晚期糖基化終產(chǎn)物介導血管內(nèi)皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其機制

發(fā)布時間：2017-06-23 13:19

本文關(guān)鍵詞：晚期糖基化終產(chǎn)物介導血管內(nèi)皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其機制，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：蛋白質(zhì)賴氨酸的氨基和還原糖的醛基之間發(fā)生非酶性糖基化反應(yīng),形成Schiff堿,經(jīng)Amadori反應(yīng)重排后形成相對穩(wěn)定的晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products, AGEs)。在糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)生過程中,AGEs大量堆積是導致糖尿病內(nèi)皮細胞損傷的重要原因。AGEs可通過介導細胞外相鄰的無關(guān)蛋白質(zhì)互相交聯(lián)等直接效應(yīng),改變被修飾蛋白的結(jié)構(gòu)和功能；AGEs也可以與特異的AGEs受體結(jié)合影響胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導、刺激細胞因子釋放、引起細胞的氧化應(yīng)激等,在糖尿病血管并發(fā)癥中發(fā)揮致病效應(yīng)。真核細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是蛋白質(zhì)折疊與成熟、脂質(zhì)生物合成以及Ca2+儲存的重要場所。生理狀態(tài)下的蛋白折疊需求增加或出現(xiàn)了打亂蛋白折疊的刺激因素,都可能使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能超負荷運轉(zhuǎn),從而導致未折疊或錯誤折疊蛋白蓄積,出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress, ER stress).為了防止未折疊或錯誤折疊蛋白蓄積,真核細胞則引發(fā)非折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response, UPR),改變細胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯程序,以處理這些蛋白同時改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激狀態(tài)。如果應(yīng)激時間過長,將不可避免地引起細胞凋亡,這是多種心血管疾病、特別是肥胖和胰島素抵抗型(2型)糖尿病發(fā)病的重要機制。靜息狀態(tài)時,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的三種感應(yīng)分子,包括蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(protein kinase R-like ER kinase,PERK)、ER轉(zhuǎn)膜蛋白激酶1α (inositol-requiring1α, IRE1α)和轉(zhuǎn)錄激活因子6(activating transcription factor6, ATF6),與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白—葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78, GRP78)結(jié)合處于非激活狀態(tài)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時,GRP78與這些感應(yīng)分子解離,以處理未折疊或錯誤折疊的蛋白,而解離后的感應(yīng)分子則被激活,啟動從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到細胞核的信號級聯(lián)放大效應(yīng),引發(fā)UPR。目的：本研究旨在闡明AGEs是否導致血管內(nèi)皮細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,并探討其介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的細胞信號轉(zhuǎn)導機制,特別是氧化應(yīng)激在其中發(fā)揮的作用。方法：本課題以人臍靜脈內(nèi)皮細胞株HUVEC為研究對象,應(yīng)用細胞培養(yǎng)、蛋白免疫印記、siRNA干擾、細胞免疫熒光等方法,觀察AGEs刺激下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標志性蛋白表達和磷酸化水平的變化及其介導內(nèi)皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的后果,并從氧化應(yīng)激角度探討AGEs介導內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的信號通路機制。 AGE修飾的牛血清白蛋白(AGE-modified bovine serum albumin AGE-BSA),由牛血清白蛋白與D-葡萄糖共孵育8周制得。體外培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細胞株HUVEC,接種于3.5cm細胞培養(yǎng)皿上,待細胞長至融合或接近融合時,換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h,使細胞獲得同步生長,然后按實驗分組分別處理備用。用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測GRP78的表達和IRE1α的磷酸化水平變化；應(yīng)用IRE1α siRNA干擾IREα1的表達,用免疫熒光染色法、激光共聚焦顯微鏡觀察NF-κB在細胞內(nèi)的分布改變,同時用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測細胞核內(nèi)NF-κB的表達變化；將臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)至密度為60-80%,予NADPH氧化酶(Nox)亞型Nox4的siRNA轉(zhuǎn)染細胞48h。另給予活性氧的抑制劑谷胱甘肽(GSH)15mmol/L預(yù)處理細胞1h,用蛋白免疫印跡技術(shù)檢測AGEs刺激后內(nèi)皮細胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志性蛋白GRP78的表達和IRE1α的磷酸化水平變化。應(yīng)用Nox4siRNA干擾Nox4蛋白的表達,用免疫熒光染色法、激光共聚焦顯微鏡觀察NF-κB在細胞內(nèi)的分布改變。用化學發(fā)光法顯示蛋白條帶,以Image J軟件分析各組灰度值。TG作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的陽性對照。結(jié)果： 1. AGE-BSA誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志性蛋白表達和活性的增高 (1) AGE-BSA以時間和劑量依賴的方式引起內(nèi)皮細胞GRP78表達的增高結(jié)果顯示,AGE-BSA刺激可引起GRP78表達顯著增加,且呈時間(F=46.609,P=0.000)和劑量(F=10.265,P=0.000)依賴性。在時間效應(yīng)組中,隨著AGE-BSA作用時間的延長,細胞中GRP78表達逐漸增高,與對照組相比,從12h起差異有統(tǒng)計學意義(P=0.000),至24h時,到達峰值(P=0.000),隨后GRP78蛋白表達開始緩慢下降,當AGE-BSA作用48h時與對照組相比差異仍有統(tǒng)計學意義(P=0.000)。劑量效應(yīng)組中,隨著AGE-BSA濃度從50mg/L逐漸增加到200mg/L,內(nèi)皮細胞中GRP78表達逐漸增多,當AGE-BSA濃度為50mg/L時,與對照組相比,差異即具有統(tǒng)計學意義(P=0.016)。同樣地,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導劑TG也可引起GRP78的表達顯著增加。 (2) AGE-BSA以時間和劑量依賴的方式引起內(nèi)皮細胞IREla磷酸化水平的增高結(jié)果顯示,AGE-BSA刺激可引起IRE1α磷酸化水平顯著增加,且呈時間(F=4.220,P=0.004)和劑量(F=5.739,P=0.000)依賴性。在時間效應(yīng)組中,隨著AGE-BSA作用時間的延長,細胞中IRE1α磷酸化水平逐漸增高,與對照組相比,從12h起差異有統(tǒng)計學意義(P=0.025),至48h時,到達峰值(P=0.004)。劑量效應(yīng)組中,隨著AGE-BSA濃度從50mg/L逐漸增加到200mg/L,內(nèi)皮細胞中IRE1α磷酸化水平逐漸增高,當AGE-BSA濃度為50mg/L時,與對照組相比,差異即具有統(tǒng)計學意義(P=0.031)。同樣地,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導劑TG也可引起IRE1α磷酸化水平顯著增高。 (3) AGE-BSA以時間和劑量依賴的方式引起內(nèi)皮細胞JNK磷酸化水平的增高結(jié)果顯示,AGE-BSA刺激可引起JNK磷酸化水平顯著增加,且呈時間(F=3.969,P=0.005)和劑量(F=4.244,P=0.002)依賴性。在時間效應(yīng)組中,隨著AGE-BSA作用時間的延長,細胞中JNK磷酸化水平逐漸增高,與對照組相比,從12h起差異有統(tǒng)計學意義(P=0.026),至24h時,到達峰值(P=0.002),隨后開始緩慢下降,當AGE-BSA作用48h時與對照組相比差異仍有統(tǒng)計學意義(P=0.005)。在劑量效應(yīng)組中,隨著AGE-BSA濃度從50mg/L逐漸增加到200mg/L,內(nèi)皮細胞中JNK磷酸化水平逐漸增高,當達到50mg/L時,與對照組相比,差異即具有統(tǒng)計學意義(P=0.011)。 2.抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對AGE-BSA誘導NF-κB入核的影響 (1) AGE-BSA誘導NF-κB激活入核給予內(nèi)皮細胞AGE-BSA100mg/L刺激12h,然后進行核質(zhì)分離,提取核蛋白,采用Western blotting方法檢測細胞核NF-κB的表達情況,結(jié)果顯示,與對照組相比,AGE-BSA刺激組的細胞核NF-κB表達顯著增加(P=0.000),結(jié)果提示：AGE-BSA誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞NF-κB入核。 (2)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對AGE-BSA誘導NF-κB入核的影響轉(zhuǎn)染IRE1α siRNA,成功抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志性蛋白IRE1α的表達。將臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)至密度為60～80%,予IRE1α siRNA和control siRNA分別轉(zhuǎn)染細胞48h,提取細胞總蛋白,采用Western blotting方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志性蛋白IRE1α的表達,結(jié)果顯示,與對照組相比,轉(zhuǎn)染IRE1α siRNA組的IRE1α表達明顯下降,而control siRNA組的IRE1α表達無明顯變化。結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染IRE1α siRNA,成功抑制了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志性蛋白IRE1α的表達。分別預(yù)轉(zhuǎn)染IRE1α siRNA和control siRNA,再給予AGE-BSA100mg/L刺激,然后進行核質(zhì)分離,提取核蛋白,采用Western blotting方法檢測細胞核NF-κB的表達情況,結(jié)果顯示,與單獨給予AGE-BSA刺激組相比,預(yù)轉(zhuǎn)染IRE1α siRNA組的細胞核NF-κB表達顯著下降(P=0.000)。而control siRNA組與AGE-BSA刺激組相比沒有顯著差異,與IRE1α siRNA組相比,差異具有統(tǒng)計意義(P=0.001)。結(jié)果提示：通過抑制IREla表達而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,可減少AGE-BSA誘導的NF-κB入核。 3.形態(tài)學觀察抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對AGE-BSA誘導NF-κB入核的影響 (1) AGE-BSA誘導NF-κB入核給予內(nèi)皮細胞AGE-BSA100mg/L刺激,然后進行免疫熒光染色,在激光共聚焦顯微鏡下觀察內(nèi)皮細胞NF-κB的核轉(zhuǎn)位情況。結(jié)果顯示,與對照組相比,AGE-BSA刺激組的核內(nèi)NF-κB染色強度明顯增加。結(jié)果提示：從形態(tài)學角度可進一步驗證AGE-BSA誘導臍靜脈內(nèi)皮細胞NF-κB入核。 (2)抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對AGE-BSA誘導NF-κB入核的影響分別預(yù)轉(zhuǎn)染IREla siRNA和control siRNA,再給予AGE-BSA100mg/L刺激,12h后進行免疫熒光染色,在激光共聚焦顯微鏡下觀察內(nèi)皮細胞NF-κB的核轉(zhuǎn)位情況。結(jié)果顯示,與單獨給予AGE-BSA刺激組相比,預(yù)轉(zhuǎn)染IRE1α siRNA組的細胞核內(nèi)NF-κB染色強度明顯減弱。而control siRNA組與AGE-BSA刺激組相比,核內(nèi)NF-κB染色強度無明顯差異。結(jié)果提示：從形態(tài)學角度可觀察到通過抑制IREla表達而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,可減少AGE-BSA誘導的NF-κB入核。 4.氧化應(yīng)激對AGE-BSA誘導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響 (1)氧化抑制對AGE-BSA誘導的GRP78蛋白表達的影響將臍靜脈內(nèi)皮細胞培養(yǎng)至密度為60-80%,予Nox4siRNA和control siRNA分別轉(zhuǎn)染細胞48h,提取細胞總蛋白,采用Western blotting方法檢測Nox4蛋白的表達,結(jié)果顯示,與對照組相比,轉(zhuǎn)染Nox4siRNA組的Nox4蛋白表達明顯下降,而control siRNA組的Nox4表達無明顯變化。結(jié)果提示,轉(zhuǎn)染Nox4siRNA,成功抑制了氧化劑Nox4蛋白的表達。使用Nox4siRNA下調(diào)Nox4的表達以及氧化抑制劑GSH分別預(yù)處理細胞后,再給予AGE-BSA100mg/L刺激,12h后提取細胞總蛋白。采用Western blotting方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標志性蛋白GRP78的表達變化,結(jié)果顯示,與單獨給予AGE-BSA刺激組相比,預(yù)轉(zhuǎn)染Nox4siRNA組(P=0.014)和GSH(P=0.005)預(yù)處理組的GRP78蛋白表達顯著下降。而control siRNA組與單獨給予AGE-BSA刺激組相比,無統(tǒng)計學差異。結(jié)果提示：氧化抑制可下調(diào)AGE-BSA誘導的GRP78蛋白表達。 (2)氧化抑制對AGE-BSA誘導的IREla磷酸化水平的影響使用Nox4siRNA下調(diào)Nox4的表達以及氧化抑制劑GSH分別預(yù)處理細胞后,再給予AGE-BSA100mg/L刺激,12h后提取細胞總蛋白。采用Western blotting方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)標志性蛋白IREla磷酸化水平的變化,結(jié)果顯示,與單獨給予AGE-BSA刺激組相比,預(yù)轉(zhuǎn)染Nox4siRNA組(P=0.041)和GSH (P=0.001)預(yù)處理組的IRE1α磷酸化水平顯著下降。而control siRNA組與單獨給予AGE-BSA刺激組相比,無統(tǒng)計學差異。結(jié)果提示：氧化抑制劑可下調(diào)AGE-BSA誘導的IREla磷酸化水平。 5.形態(tài)學觀察抑制氧化應(yīng)激對AGE-BSA誘導NF-κB入核的影響使用Nox4siRNA下調(diào)Nox4的表達以及氧化抑制劑GSH分別預(yù)處理細胞后,再給予AGE-BSA100mg/L刺激,12h后進行免疫熒光染色,在激光共聚焦顯微鏡下觀察內(nèi)皮細胞NF-κB的核轉(zhuǎn)位情況。結(jié)果顯示,與單獨給予AGE-BSA刺激組相比,預(yù)轉(zhuǎn)染Nox4siRNA組或GSH預(yù)處理組的細胞核內(nèi)NF-κB染色強度明顯減弱。而control siRNA組與AGE-BSA刺激組相比,核內(nèi)NF-κB染色強度無明顯差異。結(jié)果提示：從形態(tài)學角度可觀察到通過抑制Nox4表達或用氧化抑制劑GSH而抑制氧化應(yīng)激,可減少AGE-BSA誘導的NF-κB入核。結(jié)論： 1. AGE-BSA以時間和劑量依賴的方式引起內(nèi)皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 2.通過下調(diào)IRE1α蛋白表達抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,可抑制AGE-BSA誘導的NF-κB激活 3. AGE-BSA可通過氧化應(yīng)激途徑誘導內(nèi)皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
【關(guān)鍵詞】：晚期糖基化終產(chǎn)物 內(nèi)皮細胞 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 siRNA 氧化抑制 NF-κB
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R363
【目錄】：