發(fā)布時(shí)間：2017-06-22 21:11

  本文關(guān)鍵詞：HDAC8調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的機(jī)制研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）是一種能夠分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞或成脂細(xì)胞的多潛能干細(xì)胞。由于易于獲取且免疫反應(yīng)小等特點(diǎn)，臨床上利用BMSCs進(jìn)行骨缺損的修復(fù)逐漸成為研究者關(guān)注的焦點(diǎn)，目前對于BMSCs修復(fù)骨缺損能力的研究主要集中于如何提高其成骨分化的能力。最近研究發(fā)現(xiàn)組蛋白去乙�；福℉DACs）家族的許多成員在BMSCs成骨分化過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用，本實(shí)驗(yàn)檢測HDAC8對BMSCs成骨分化能力的影響，并進(jìn)一步探索HDAC8在BMSCs成骨分化過程中的調(diào)控機(jī)制，為將來臨床骨缺損再生修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分：大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性鑒定 目的：體外提取并培養(yǎng)大鼠BMSCs，對大鼠BMSCs的生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。 方法：利用全骨髓貼壁法體外提取并培養(yǎng)大鼠BMSCs，三天后換液除去造血細(xì)胞等未貼壁細(xì)胞，待細(xì)胞形成單克隆集落并且當(dāng)各集落相互接觸時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)；通過克隆形成率分析、MTT分析、流式細(xì)胞周期分析對BMSCs的增殖能力進(jìn)行鑒定；通過流式細(xì)胞儀對BMSCs表面抗原進(jìn)行檢測；通過礦化誘導(dǎo)、成脂誘導(dǎo)液培養(yǎng)BMSCs并進(jìn)行油紅O染色、茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色檢測BMSCs的多向分化能力。 結(jié)果：穩(wěn)定培養(yǎng)的BMSCs呈紡錘形，細(xì)胞胞體豐滿，胞核較大，呈漩渦分布；體外培養(yǎng)的BMSCs具有較強(qiáng)的自我增殖能力且不易分化；經(jīng)流式表面抗原標(biāo)記檢測，BMSCs中CD29陽性表達(dá)，造血干細(xì)胞標(biāo)記CD34陰性表達(dá)；經(jīng)過礦化誘導(dǎo)及成脂誘導(dǎo)后，BMSCs能夠向成骨細(xì)胞及脂肪細(xì)胞定向分化，具有多向分化潛力。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)通過全骨髓貼壁培養(yǎng)法獲得BMSCs，體外培養(yǎng)的細(xì)胞呈貼壁的紡錘體樣旋渦狀生長，具有自我增殖的能力，表面抗原干細(xì)胞標(biāo)記陽性表達(dá)，能夠在誘導(dǎo)下多向分化，具有干細(xì)胞特性，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。 第二部分：HDAC8對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響 目的：檢測大鼠BMSCs成骨分化過程中HDAC8的表達(dá)規(guī)律，研究HDAC8在BMSCs成骨分化過程中所發(fā)揮的作用。 方法：1、Western blot及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測BMSCs成骨分化過程中HDAC8的表達(dá)規(guī)律；構(gòu)建HDAC8過表達(dá)慢病毒載體并轉(zhuǎn)染大鼠BMSCs，實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot檢測轉(zhuǎn)染效率；MTT檢測轉(zhuǎn)染后BMSCs的增殖情況；堿性磷酸酶活性測定、茜素紅鈣結(jié)節(jié)染色、Western blot及實(shí)時(shí)定量PCR檢測礦化誘導(dǎo)7天后BMSCs成骨能力的變化。2、加入1mM VPA后，，Western blot檢測BMSCs中HDAC8的表達(dá)，MTT檢測BMSCs的增殖情況，茜素紅礦化結(jié)節(jié)染色、Westernblot及實(shí)時(shí)定量PCR檢測BMSCs成骨能力的變化；HDAC8-siRNA化學(xué)干擾試劑轉(zhuǎn)染BMSCs，Western blot及實(shí)時(shí)定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效率及礦化誘導(dǎo)7天后BMSCs成骨能力的變化；轉(zhuǎn)染HDAC8過表達(dá)慢病毒載體的BMSCs中加入1mM VPA，實(shí)時(shí)定量PCR及Western blot檢測礦化誘導(dǎo)7天后過表達(dá)HDAC8的BMSCs成骨能力的變化。 結(jié)果：1、BMSCs成骨分化過程中HDAC8表達(dá)呈遞減趨勢；HDAC8過表達(dá)慢病毒載體轉(zhuǎn)染BMSCs后倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率，大部分BMSCs表達(dá)綠色熒光，HDAC8蛋白水平及mRNA水平明顯上調(diào)，轉(zhuǎn)染后BMSCs的增殖能力未見明顯改變；礦化誘導(dǎo)7天后轉(zhuǎn)染HDAC8過表達(dá)慢病毒載體的BMSCs成骨相關(guān)基因表達(dá)下降且礦化結(jié)節(jié)形成能力下降。2、加入1mM VPA后，BMSCs的HDAC8在24小時(shí)內(nèi)表達(dá)逐漸下降，且BMSCs的增殖能力有所下降，礦化誘導(dǎo)7天后BMSCs的成骨相關(guān)基因表達(dá)增強(qiáng)且礦化結(jié)節(jié)形成能力增強(qiáng)；轉(zhuǎn)染HDAC8-siRNA化學(xué)干擾試劑后BMSCs的HDAC8表達(dá)明顯降低，礦化誘導(dǎo)7天后其成骨能力有所增強(qiáng)；轉(zhuǎn)染HDAC8過表達(dá)慢病毒載體的BMSCs中加入1mM VPA后經(jīng)礦化誘導(dǎo)，成骨相關(guān)基因的表達(dá)均有增強(qiáng)。 結(jié)論：HDAC8對大鼠BMSCs成骨分化具有抑制作用。 第三部分：HDAC8在大鼠BMSCs成骨分化過程中的調(diào)控機(jī)制 目的：檢測大鼠BMSCs成骨分化過程中組蛋白H3K9乙酰化水平的變化規(guī)律，研究組蛋白H3K9、HDAC8與RUNX2的相互作用，進(jìn)一步探索HDAC8在大鼠BMSCs成骨分化過程中的調(diào)控機(jī)制。 方法：Western blot及免疫熒光細(xì)胞化學(xué)檢測BMSCs成骨分化過程中組蛋白H3K9乙酰化水平的變化規(guī)律；Western blot檢測過表達(dá)HDAC8的BMSCs及抑制或干擾HDAC8的BMSCs中組蛋白H3K9的乙酰化水平；ChIP檢測礦化誘導(dǎo)前后RUNX2啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3K9的乙酰化水平變化；co-IP檢測礦化誘導(dǎo)前后HDAC8與RUNX2的相互作用。 結(jié)果：BMSCs成骨分化過程中組蛋白H3K9的乙�；街饾u增強(qiáng)；HDAC8過表達(dá)的BMSCs中組蛋白H3K9的乙�；较陆担鳫DAC8受到抑制或者干擾的BMSCs中組蛋白H3K9的乙�；接兴岣�；ChIP結(jié)果顯示礦化誘導(dǎo)后RUNX2啟動(dòng)子區(qū)組蛋白H3K9乙酰化水平較誘導(dǎo)前高，co-IP結(jié)果顯示HDAC8與RUNX2在此次免疫共沉淀中均有表達(dá)，并且在礦化誘導(dǎo)后RUNX2結(jié)合的HDAC8蛋白水平較誘導(dǎo)前有所下降。 結(jié)論：HDAC8一方面通過直接與成骨關(guān)鍵調(diào)控因子RUNX2結(jié)合，抑制BMSCs的成骨分化；另一方面通過調(diào)節(jié)組蛋白H3K9乙酰化水平間接調(diào)控RUNX2的轉(zhuǎn)錄從而抑制BMSCs成骨分化。
【關(guān)鍵詞】：組蛋白去乙酰化酶8 runt-相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 成骨分化 組蛋白H3K9乙�；�
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R329
【目錄】：

• 英文縮略詞表7-8
• 中文摘要8-11
• Abstract11-15
• 前言15-18
• 第一部分 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)和生物學(xué)特性鑒定18-32
• 材料和方法18-23
• 結(jié)果23-29
• 討論29-31
• 小結(jié)31-32
• 第二部分 HDAC8 對大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的影響32-64
• 第一節(jié) HDAC8 過表達(dá)載體的構(gòu)建及其對大鼠 BMSCs 成骨分化的影響32-54
• 材料和方法32-46
• 結(jié)果46-54
• 第二節(jié) HDAC8 抑制對大鼠 BMSCs 成骨分化的影響54-61
• 材料和方法54-55
• 結(jié)果55-61
• 討論61-63
• 小結(jié)63-64
• 第三部分 HDAC8 在大鼠 BMSCs 成骨分化過程中的調(diào)控機(jī)制64-77
• 材料和方法64-70
• 結(jié)果70-74
• 討論74-76
• 小結(jié)76-77
• 全文總結(jié)77-79
• 參考文獻(xiàn)79-84
• 綜述84-98
• 參考文獻(xiàn)92-98
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況98-99
• 致謝99

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 夏靖;馮冰虹;;組蛋白去乙酰化酶(HDACs)的研究進(jìn)展[J];廣東藥學(xué)院學(xué)報(bào);2010年05期

2 周榮睿;李江;;組蛋白乙酰化與頭頸部惡性腫瘤[J];國際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2007年06期

3 孫開勝,徐克前;組蛋白乙�；�/去乙酰化與基因表達(dá)調(diào)控[J];生命科學(xué)研究;2004年S1期

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本文編號(hào)：473107