本文關(guān)鍵詞：抗冷凍蛋白AFPⅢ在玻璃化冷凍過程中對(duì)小鼠卵母細(xì)胞和胚胎保護(hù)作用的研究，，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 第一部分抗冷凍蛋白AFPⅢ對(duì)小鼠2-細(xì)胞胚胎的冷凍保護(hù)作用 將抗冷凍蛋白AFPⅢ應(yīng)用于小鼠2-細(xì)胞胚胎的玻璃化冷凍保存,觀察其對(duì)細(xì)胞微絲骨架結(jié)構(gòu)是否有保護(hù)作用和胚胎冷凍復(fù)蘇后發(fā)育潛能。 第二部分抗冷凍蛋白AFPⅢ對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的冷凍保護(hù)作用 觀察玻璃化冷凍對(duì)小鼠MⅡ期卵母細(xì)胞的損傷及抗冷凍蛋白AFPⅢ是否在冷凍過程中對(duì)其細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能起保護(hù)作用。 方法 第一部分抗冷凍蛋白AFPⅢ對(duì)小鼠2-細(xì)胞胚胎的冷凍保護(hù)作用 1.2-細(xì)胞胚胎獲取：健康性成熟昆明系雌性小鼠,8-12周齡,質(zhì)量30-35g,腹腔注射PMSG10IU/只,48h后腹腔注射HCG10IU/只,與雄性性成熟昆明小鼠按照1：1合籠過夜,次日清晨觀察雌鼠陰道栓,將有陰道栓的雌鼠和雄鼠分開飼養(yǎng),在注射HCG后的46-48h后頸椎脫臼法處死雌性小鼠,在體視鏡下分離出輸卵管,用無菌針頭刺破輸卵管壺腹膨大處,獲取2-細(xì)胞小鼠胚胎。 2.分組：將獲得1200枚胚胎隨機(jī)分為新鮮對(duì)照組、玻璃化冷凍組及添加AFPⅢ (500ng/mL)玻璃化冷凍組,每組400枚,200枚繼續(xù)培養(yǎng)觀察發(fā)育潛能,200枚行微絲免疫熒光染色。 3.玻璃化冷凍復(fù)蘇：2-細(xì)胞胚胎采用玻璃化冷凍,冷凍復(fù)蘇存活的胚胎繼續(xù)培養(yǎng)觀察其囊胚形成情況,并統(tǒng)計(jì)冷凍組復(fù)蘇率和三組的囊胚形成率。 4.胚胎微絲觀察：固定、透化、封閉的胚胎加入預(yù)熱到37℃的0.1ug/mLFITC-結(jié)合的鬼筆環(huán)肽,免疫熒光染色60分鐘,統(tǒng)計(jì)三組微絲完整比率。 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用X1檢驗(yàn),檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)均為0.05,P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 第二部分抗冷凍蛋白AFPⅢ對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的冷凍保護(hù)作用 1.卵母細(xì)胞獲�。航】敌猿墒炖ッ鞔菩孕∈�,8-12周齡,質(zhì)量30-35g,腹腔注射PMSG10IU/只,48h后腹腔注射HCG10IU/只,18-20h后頸椎脫臼法處死小鼠,在體視鏡下分離卵巢、部分子宮和輸卵管,刺破輸卵管壺腹部獲取成熟卵母細(xì)胞(MII期)。 2.分組：將獲取卵母細(xì)胞1200枚隨機(jī)分為IV組,分別為新鮮對(duì)照組,添加冷凍保護(hù)新鮮組,玻璃化冷凍組,添加AFPⅢ (500ng/mL)玻璃化冷凍組,每組300枚,其中100枚進(jìn)行體外授精觀察其囊胚形成率,100枚行微管微絲免疫熒光染色,100枚行實(shí)時(shí)定量PCR分析相關(guān)基因的表達(dá)。 3.玻璃化冷凍復(fù)蘇：卵母細(xì)胞行玻璃化冷凍,玻璃化冷凍組復(fù)蘇存活的卵母細(xì)胞行體外受精。 4.精子獲�。盒坌孕∈蟾讲G尾部獲取精子懸液,進(jìn)行梯度離心處理,在倒置顯微鏡下將已獲能的精子至于G-IVF培養(yǎng)液中并調(diào)整密度為3-6×106/mL。 5.體外受精：向含有精子的培養(yǎng)液中添加卵母細(xì)胞,37℃、6%CO2培養(yǎng)箱中共同孵育,受精后5-9h觀察雙原核出現(xiàn)情況,于受精后第2、3、4、5天分別觀察2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞及囊胚的發(fā)育情況,并計(jì)算受精率,囊胚形成率。 6.微管蛋白觀察：固定、透化、封閉后的卵母細(xì)胞加入預(yù)熱到37℃,1：250稀釋的抗小鼠a-tubulin單克隆抗體,4℃封閉過夜,37℃、1：100稀釋的FITC結(jié)合的山羊抗兔IgG,37℃培養(yǎng)箱中避光染色120min。 7.微絲觀察：將已固定、透化、封閉的卵母細(xì)胞、2細(xì)胞、4細(xì)胞、8細(xì)胞和囊胚加入預(yù)熱到37℃、0.1ug/mLFITC-結(jié)合的鬼筆環(huán)肽,37℃、6%CO：培養(yǎng)箱中避光染色60min。 8.染色體觀察：經(jīng)微管、微絲染色后清洗的卵母細(xì)胞在室溫下置于DAPI中避光反染3min。 .9.熒光實(shí)時(shí)定量PCR測定基因的表達(dá)：通過卵母細(xì)胞的裂解、分離、.沉淀、RNA的洗脫、再溶解；紫外分光光度儀測量RNA的純度和濃度,逆轉(zhuǎn)錄,實(shí)時(shí)定量PCR (10μL體系)方法來測定基因Mad2、Eg5、Cenp-e和Cirbp的相對(duì)表達(dá)量。 10.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)量資料采用t檢驗(yàn),計(jì)數(shù)資料統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用X2檢驗(yàn),四組基因表達(dá)量用GraphPad Prism5軟件U檢驗(yàn)進(jìn)行分析,mRNA提取實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)三次。檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)均為0.05,P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果 第一部分抗冷凍蛋白AFPⅢ對(duì)小鼠2-細(xì)胞胚胎的冷凍保護(hù)作用 1.添加AFPⅢ玻璃化冷凍組胚胎復(fù)蘇率高于玻璃化冷凍組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2.新鮮對(duì)照組和添加AFPⅢ玻璃化冷凍組囊胚形成率、微絲完整胚胎比率均高于玻璃化冷凍組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；新鮮對(duì)照組和添加AFPⅢ玻璃化冷凍組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 第二部分抗冷凍蛋白AFPⅢ對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的冷凍保護(hù)作用 1. AFPⅢ玻璃化冷凍組卵母細(xì)胞紡錘體、微絲和染色體完整的比率高于玻璃化冷凍組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),新鮮對(duì)照組和添加冷凍保護(hù)劑新鮮組之間沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但是顯著高于后兩組且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 2.新鮮對(duì)照組、添加冷凍保護(hù)劑新鮮組及AFPⅢ玻璃化冷凍組Mad2、CENP-E mRNA相對(duì)表達(dá)量高于玻璃化冷凍組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；然而玻璃化冷凍組CIRP、Eg5的mRNA相對(duì)表達(dá)量高于其他三組,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其他三組表達(dá)量沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 3.新鮮對(duì)照組、添加冷凍保護(hù)劑新鮮組的受精率高于其他兩組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而AFPⅢ玻璃化冷凍組復(fù)蘇率、受精率均高于玻璃化冷凍組,且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),前兩組之間沒有顯著性差異(P0.05)。四組的囊胚形成率沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論 第一部分抗冷凍蛋白AFPⅢ對(duì)小鼠2-細(xì)胞胚胎的冷凍保護(hù)作用 1.添加AFPⅢ玻璃化冷凍組胚胎復(fù)蘇率高于玻璃化冷凍組。 2.新鮮對(duì)照組和添加AFPⅢ玻璃化冷凍組囊胚形成率、微絲完整胚胎比率均高于玻璃化冷凍組。 3.新鮮對(duì)照組和添加AFPⅢ玻璃化冷凍組之間無顯著性差異。 第二部分抗冷凍蛋白AFPⅢ對(duì)小鼠卵母細(xì)胞的冷凍保護(hù)作用 1. AFPⅢ玻璃化冷凍組卵母細(xì)胞紡錘體、微絲和染色體完整的比率高于玻璃化冷凍組,新鮮對(duì)照組和添加冷凍保護(hù)劑新鮮組之間沒有顯著性差異,但是顯著高于后兩組。 2.新鮮對(duì)照組、添加冷凍保護(hù)劑新鮮組及AFPⅢ玻璃化冷凍組Mad2、CENP-E mRNA相對(duì)表達(dá)量高于玻璃化冷凍組；然而玻璃化冷凍組CIRP、Eg5的mRNA相對(duì)表達(dá)量高于其他三組,其他三組表達(dá)量沒有顯著性差異。 3.新鮮對(duì)照組、添加冷凍保護(hù)劑新鮮組的受精率高于其他兩組,而AFPⅢ玻璃化冷凍組復(fù)蘇率、受精率均高于玻璃化冷凍組,前兩組之間沒有顯著性差異。四組的囊胚形成率沒有顯著性差異。
【關(guān)鍵詞】：抗冷凍蛋白AFPⅢ 胚胎 成熟卵母細(xì)胞 玻璃化冷凍 細(xì)胞骨架
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R321
【目錄】：

• 中文摘要6-10
• ABSTRACT10-16
• 符號(hào)說明16-18
• 前言18-20
• 材料方法20-28
• 結(jié)果28-30
• 討論30-38
• 結(jié)論38-39
• 附圖39-43
• 附表43-45
• 綜述45-54
• 參考文獻(xiàn)54-60
• 論文參考文獻(xiàn)54-56
• 綜述參考文獻(xiàn)56-60
• 致謝60-61
• 攻讀碩士期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文61-62
• 學(xué)位論文評(píng)閱及答辯情況表62

【參考文獻(xiàn)】

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1 汪少蕓;趙s

本文編號(hào)：465639