發(fā)布時(shí)間：2017-06-16 14:01

  本文關(guān)鍵詞：構(gòu)建Gab1特異RNAi慢病毒載體及其對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：目的 構(gòu)建針對(duì)人類生長(zhǎng)因子受體結(jié)合蛋白2相關(guān)的接頭蛋白1（Grb2-AssociatedBinder1，Gab1）基因的慢病毒干擾載體，從轉(zhuǎn)錄后水平抑制Gab1基因的表達(dá)，并將構(gòu)建的慢病毒RNA干擾載體載染人血管內(nèi)皮細(xì)胞，研究沉默細(xì)胞內(nèi)Gab1基因表達(dá)后對(duì)細(xì)胞增殖能力的影響。 方法 針對(duì)人類Gab1基因設(shè)計(jì)5個(gè)靶點(diǎn)的SiRNA序列，并分別合成靶序列的Oligo DNA，，退火形成雙鏈DNA，與經(jīng)Hpa I和Xho I限制性內(nèi)切酶雙酶切后的GV118載體連接，產(chǎn)生Gab1 RNAi重組質(zhì)粒，PCR篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序鑒定。將各個(gè)靶點(diǎn)的重組質(zhì)粒與構(gòu)建的Gab1過(guò)表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，通過(guò)Western bolt檢測(cè)Gab1蛋白表達(dá)水平來(lái)篩遷最佳干擾靶點(diǎn)的重組質(zhì)粒，再將最佳的Gab1 RNAi重組質(zhì)粒、pHelper1.0和pHelper2.0質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染239T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生LV Gab1 RNAi慢病毒并測(cè)定其滴度。并將獲得的慢病毒分別載染EA.hy926細(xì)胞，通過(guò)熒光顯微鏡觀察GFP的表達(dá)情況，測(cè)定其轉(zhuǎn)染效率；通過(guò)RT PCR和Western bolt檢測(cè)轉(zhuǎn)染后的EA.hy926細(xì)胞中Gab1mRNA和蛋白表達(dá)水平來(lái)驗(yàn)證慢病毒干擾載體的基因沉默效率。將構(gòu)建好的慢病毒干擾載體載染EA.hy926細(xì)胞，在細(xì)胞接種后第1、2、3、4、5d利用MTT分析方法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的影響。 結(jié)果 1、篩選陽(yáng)性克隆經(jīng)ＰＣＲ及測(cè)序鑒定，成功將Gab1靶向含shRNA的雙鏈DNA 序列插入GV118載體中即Gab1 RNAi重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。 2、包裝產(chǎn)生的LV Gab1 RNAi慢病毒載染293T細(xì)胞，測(cè)定的滴度為3×109TU/ml。 3、RT-PCR和Western Blot檢測(cè)RNAi慢病毒載染后的血管內(nèi)皮細(xì)胞中目的基因 表達(dá)水平，證實(shí)構(gòu)建的慢病毒干擾載體可以高效抑制Gab1基因的表達(dá)。 4、沉默血管內(nèi)皮細(xì)胞中Gab1基因表達(dá)后，細(xì)胞增殖受到明顯的抑制。 結(jié)論 構(gòu)建的特異RNAi慢病毒能夠高效載染血管內(nèi)皮細(xì)胞，并且細(xì)胞內(nèi)Gab1目的基因mRNA和蛋白的表達(dá)水平顯著降低，可為研究基因沉默前后血管內(nèi)皮細(xì)胞生物學(xué)行為的改變和探討Gab1基因在血管新生中的作用提供有效技術(shù)手段；Gab1基因在促進(jìn)細(xì)胞增殖方面有重要作用。
【關(guān)鍵詞】：Gab1 RNA干擾 慢病毒載體 基因載染 血管內(nèi)皮細(xì)胞 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R3416
【目錄】：

• 主要英文縮略索引4-6
• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 引言10-12
• 第一部分 Gab1 基因特異 RNAi 慢病毒載體的構(gòu)建12-41
• 材料和方法12-29
• 結(jié)果29-37
• 討論37-41
• 第二部分 RNAi 慢病毒載體的內(nèi)源驗(yàn)證及對(duì) EA.hy926 細(xì)胞增殖的影響41-53
• 材料和方法41-46
• 結(jié)果46-50
• 討論50-53
• 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 致謝59-60
• 綜述60-65
• 參考文獻(xiàn)63-65

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 姜秋紅;高惠君;姚樹人;;腫瘤新生血管生成抑制劑的研究進(jìn)展[J];中國(guó)臨床藥學(xué)雜志;2009年03期

2 胥傳飛;盧晟盛;王友亮;楊曉;;接頭蛋白Gab1的結(jié)構(gòu)及功能研究進(jìn)展[J];生物技術(shù)通訊;2009年06期

3 溫紹君,王金城,張忱,張文,文杰,王佐廣,劉潔琳,周其文;冠脈搭橋圍手術(shù)期腫瘤壞死因子和內(nèi)皮素的動(dòng)態(tài)變化及意義[J];中華醫(yī)學(xué)雜志;2001年23期

  本文關(guān)鍵詞：構(gòu)建Gab1特異RNAi慢病毒載體及其對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖影響的研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

本文編號(hào)：455526