本文關(guān)鍵詞：人3、7型腺病毒單克隆抗體制備及應(yīng)用研究，由筆耕文化傳播整理發(fā)布。

【摘要】：【目的】在先前的研究中，本課題組將人7型腺病毒的中和表位嵌入3型腺病毒載體衣殼，構(gòu)建出人3、7型嵌合腺病毒rAdMHE3。本論文旨在用rAdMHE3作為抗原免疫小鼠，，并采用雜交瘤技術(shù)制備出針對(duì)人7型腺病毒的具有中和活性的單克隆抗體（中和單抗），探討采用衣殼嵌合策略構(gòu)建的重組腺病毒用作免疫原，制備針對(duì)嵌入的中和表位的中和單抗的可行性；制備出人3型腺病毒的中和單抗，并用這些單抗對(duì)人3型腺病毒的中和表位進(jìn)行鑒定；制備出針對(duì)人3型腺病毒的一系列單抗，并從中篩選出腺病毒直接免疫熒光法檢測(cè)用的單抗，為建立腺病毒的直接免疫熒光檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。 【方法】用HEp-2細(xì)胞或AD293細(xì)胞擴(kuò)增rAdMHE3，后者用氯化銫梯度離心純化后免疫BALB/c小鼠，用雜交瘤技術(shù)制備出針對(duì)rAdMHE3的單抗。用體外腺病毒中和實(shí)驗(yàn)篩選出中和單抗，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot）、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）和抗體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)ELISA對(duì)中和單抗進(jìn)行鑒定。用直接免疫熒光實(shí)驗(yàn)篩選出腺病毒直接免疫熒光法檢測(cè)用的單抗。 【結(jié)果】共獲得22株針對(duì)rAdMHE3的單抗，從中經(jīng)體外腺病毒中和實(shí)驗(yàn)篩選出3株特異中和人3型腺病毒的單抗、4株特異中和人7型腺病毒的單抗。經(jīng)進(jìn)一步鑒定，4株人7型腺病毒中和單抗均識(shí)別7型腺病毒的六鄰體高變區(qū)5內(nèi)的血清型特異性中和表位，并且該表位被證明是構(gòu)象表位；3株人3型腺病毒中和單抗識(shí)別的表位均為線性表位，且該表位位于3型腺病毒的六鄰體高變區(qū)4。經(jīng)直接免疫熒光實(shí)驗(yàn)，篩選出4株單抗可特異識(shí)別人7型腺病毒，2株單抗可特異識(shí)別人3型腺病毒，10株單抗可識(shí)別人3、4和7型腺病毒。 【結(jié)論】本論文初步證明了，中和表位衣殼嵌合策略構(gòu)建的重組腺病毒用于制備針對(duì)嵌入的中和表位的中和單抗是可行的；人7型腺病毒的六鄰體高變區(qū)5內(nèi)的血清型特異性中和表位為構(gòu)象表位；人3型腺病毒的六鄰體高變區(qū)4內(nèi)可能含有線性的血清型特異性中和表位。
【關(guān)鍵詞】：人腺病毒 衣殼嵌合 高變區(qū) 中和表位 單克隆抗體
【學(xué)位授予單位】：廣州醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R392
【目錄】：

• 摘要7-9
• Abstract9-11
• 主要符號(hào)表11-12
• 前言12-16
• 1 采用衣殼嵌合策略構(gòu)建的重組腺病毒在單克隆抗體的制備中的應(yīng)用12
• 2 治療性抗體在病毒感染性疾病中的應(yīng)用12-13
• 3 腺病毒感染和腺病毒中和表位鑒定13-16
• 材料和方法16-30
• 1 材料16-18
• 1.1 菌株和質(zhì)粒16
• 1.2 動(dòng)物、細(xì)胞和病毒株16-17
• 1.3 試劑和耗材17-18
• 1.4 主要儀器18
• 2 人 7 型腺病毒六鄰體高變區(qū) 5（HAdv-7 HVR5）肽合成、偶聯(lián)及GST-HVR5 融合蛋白表達(dá)18-20
• 2.1 HAdv-7 HVR5 肽的化學(xué)合成及偶聯(lián)18
• 2.2 氯化鈣法制備大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞及轉(zhuǎn)化18-19
• 2.3 HVR5-GST 融合蛋白的表達(dá)與純化19-20
• 3 重組病毒大量培養(yǎng)與純化20-21
• 4 rAdMHE3 單克隆抗體制備21-23
• 4.1 免疫小鼠21-22
• 4.2 免疫后脾細(xì)胞和雜交瘤細(xì)胞融合22
• 4.3 陽(yáng)性雜交瘤的篩選、單克隆及誘導(dǎo)腹水22-23
• 4.4 陽(yáng)性雜交瘤的單克隆及誘導(dǎo)腹水23
• 5 rAdMHE3 腹水效價(jià)的測(cè)定23
• 6 抗體亞類分析23-24
• 7 腹水純化24
• 8 單抗辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記24-25
• 9 體外腺病毒中和實(shí)驗(yàn)25
• 10 人腺病毒 7 型中和抗體的鑒定25-27
• 10.1 抗體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng) ELISA25
• 10.2 重組腺病毒結(jié)合實(shí)驗(yàn)25-26
• 10.3 小鼠免疫血清的制備26
• 10.4 人 3 型和 7 型腺病毒六鄰體重組蛋白（A3H 和 A7nH）、HVR5-GST融合蛋白（GST-A7R5）和 BSA 偶聯(lián) HVR5 合成肽（BSA-A7R5）結(jié)合實(shí)驗(yàn)26
• 10.5 免疫印跡實(shí)驗(yàn)26-27
• 11 針對(duì) Ad3EGFP 的中和單抗鑒定27-29
• 11.1 腺病毒結(jié)合實(shí)驗(yàn)27
• 11.2 六鄰體重組蛋白 A3H 和 A7nH 結(jié)合實(shí)驗(yàn)27-28
• 11.3 免疫印跡分析28
• 11.4 GST 融合肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)28-29
• 12 直接免疫熒光實(shí)驗(yàn)29
• 12.1 異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記單抗29
• 12.2 直接免疫熒光實(shí)驗(yàn)29
• 13 統(tǒng)計(jì)分析29-30
• 結(jié)果30-44
• 1 針對(duì) HAdv-7 的中和單抗鑒定31-36
• 1.1 抗體結(jié)合競(jìng)爭(zhēng) ELISA31-32
• 1.2 腺病毒結(jié)合實(shí)驗(yàn)32-34
• 1.3 免疫印跡實(shí)驗(yàn)34
• 1.4 血清體外腺病毒中和實(shí)驗(yàn)34-36
• 1.5 重組蛋白和合成肽結(jié)合實(shí)驗(yàn)36
• 2 針對(duì) Ad3EGFP 的中和單抗鑒定36-39
• 2.1 免疫印跡分析36-37
• 2.2 腺病毒結(jié)合實(shí)驗(yàn)37-38
• 2.3 重組蛋白結(jié)合實(shí)驗(yàn)38-39
• 3 直接免疫熒光實(shí)驗(yàn)39-44
• 討論44-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 綜述52-68
• 參考文獻(xiàn)61-68
• 攻讀學(xué)位期間取得的研究成果68-69
• 致謝69-70

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