乳鐵蛋白也稱乳轉(zhuǎn)鐵蛋白，是乳汁中主要的鐵結(jié)合蛋白，廣泛分布于多種組織、細(xì)胞內(nèi)，具有非特異性免疫、參與鐵代謝和細(xì)胞生長調(diào)節(jié)等功能。與其它動(dòng)物乳鐵蛋白相比，人乳鐵蛋白更適于人類食用，為了滿足需求，應(yīng)選擇合適的系統(tǒng)，進(jìn)行人乳鐵蛋白基因的異源表達(dá)。目前常用的表達(dá)系統(tǒng)中，動(dòng)物乳腺是人乳鐵蛋白基因表達(dá)較為合適的器官。因此，我們克隆了人乳鐵蛋白cDNA，構(gòu)建了乳腺特異表達(dá)載體，在小鼠乳腺癌細(xì)胞和個(gè)體內(nèi)進(jìn)行了表達(dá)，并利用精子載體法嘗試了轉(zhuǎn)基因兔、轉(zhuǎn)基因羊的制備。 首先利用RT-PCR方法從人乳腺組織中擴(kuò)增出乳鐵蛋白cDNA序列；PCR擴(kuò)增了800bp的山羊β-乳球蛋白基因5′端調(diào)控序列。通過同源序列-PCR擴(kuò)增方法連接得到的片段，酶切后克隆到表達(dá)載體中，獲得人乳鐵蛋白基因乳腺特異表達(dá)載體pLNCXHLF。 脂質(zhì)體包裹pLNCXHLF，轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌細(xì)胞MA-782，通過G418、PCR篩選獲得陽性單克隆細(xì)胞。陽性細(xì)胞用海藻酸鈉包埋培養(yǎng)，加入激素誘導(dǎo)，檢測(cè)結(jié)果表明：培養(yǎng)液上清含有人乳鐵蛋白，分子量為34KD，最高含量為65mg／L／10～5細(xì)胞；重組人乳鐵蛋...

【文章頁數(shù)】：134 頁

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
摘要
英文摘要
第一章 前言
    一 研究背景
    二 選題依據(jù)及目的意義
    三 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線
第二章 文獻(xiàn)綜述
    一 乳鐵蛋白研究現(xiàn)狀
        (一) 分布及含量
        (二) 結(jié)構(gòu)及特性
        (三) 乳鐵蛋白的代謝
        (四) 生物學(xué)功能
        (五) 乳鐵蛋白基因
        (六) 重組人乳鐵蛋白
        (七) 應(yīng)用展望
    二 乳腺生物反應(yīng)器研究進(jìn)展
        (一) 乳腺生物反應(yīng)器優(yōu)勢(shì)及存在的問題
        (二) 乳腺生物反應(yīng)器的表達(dá)構(gòu)件
        (三) 乳腺生物反應(yīng)器研究狀況
    三 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究
        (一) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物開發(fā)價(jià)值比較
        (二) 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制備方法
        (三) 外源基因載體
    四 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物研究中存在的問題
    參考文獻(xiàn)
第三章 人乳鐵蛋白基因克隆及載體構(gòu)建
    一 材料與試劑
    二 實(shí)驗(yàn)方法
        1 山羊β-乳球蛋白基因5′端調(diào)控序列的克隆
        2 人乳鐵蛋白cDNA克隆
        3 載體構(gòu)建
    三 結(jié)果與分析
    四 討論
    五 小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
第四章 人乳鐵蛋白cDNA的細(xì)胞表達(dá)
    一 材料及試劑
    二 實(shí)驗(yàn)方法
        1 G418細(xì)胞毒性的檢測(cè)
        2 激素誘導(dǎo)條件的選擇
        3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選
        4 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的PCR檢測(cè)
        5 轉(zhuǎn)染細(xì)胞的固定化培養(yǎng)
        6 轉(zhuǎn)染細(xì)胞誘導(dǎo)表達(dá)及樣品處理
        7 誘導(dǎo)產(chǎn)物檢測(cè)
        8 重組人乳鐵蛋白分析
    三 結(jié)果與分析
    四 討論
    五 小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
第五章 轉(zhuǎn)人乳鐵蛋白基因小鼠制備及外源基因表達(dá)
    一 材料及主要試劑
    二 實(shí)驗(yàn)方法
        1 質(zhì)粒注入
        2 子鼠PCR檢測(cè)
        3 子鼠Southern檢測(cè)
        4 乳汁Dot-ELISA檢測(cè)
        5 乳汁Western blotting檢測(cè)
        6 ELISA法測(cè)定乳汁中重組蛋白含量
    三 結(jié)果與分析
    四 討論
    五 小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
第六章 轉(zhuǎn)基因兔及羊的制備
    一 材料及主要試劑
    二 實(shí)驗(yàn)方法
        1 睪丸組織注射法
        2 輸精管內(nèi)成熟精子轉(zhuǎn)染法
    三 結(jié)果與分析
    四 討論
    五 小結(jié)
    參考文獻(xiàn)
第七章 結(jié)論與展望
    一 主要結(jié)論
    二 本論文的創(chuàng)新之處
    三 有待于進(jìn)一步開展的工作
    四 展望
縮略語
附錄
完成的論文
個(gè)人簡歷
致謝



本文編號(hào)：4035360