【目的】絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶K(Serine/Threonine protein kinases K)是分枝桿菌類似真核樣的蛋白激酶,預測在分枝桿菌的生長和新陳代謝等生理過程中起著重要的作用,解析PknK的生物功能及作用機制,將為結核病的防治提供一定的理論基礎�！痉椒ā客ㄟ^基因敲除等遺傳方法獲得結核分枝桿菌疫苗株BCG的pknK敲除菌株△pknK、回補菌株pMV361-pknK/△pknK和過表達菌株pMV261-pknK/BCG;對獲得的菌株進行生長曲線測定和抗藥性分析;通過pulldown-MS方法及生物信息學方法鑒定了PknK相互作用蛋白�！窘Y果】監(jiān)測各種分枝桿菌△pknK、pMV361-pknK/△pknK和pMV261-pknK/BCG生長,確定PknK負調控BCG生長;抗藥性分析顯示PknK降低BCG的耐藥性;pulldown-MS方法顯示PknK與絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PknA和雙組分系統(tǒng)中的反應調節(jié)因子MtrA、TrcR、MoxR等蛋白相互作用。【結論】研究發(fā)現PknK調控分枝桿菌的生長和耐藥性,我們的研究為深入研究PknK在結核分枝桿菌中的功能奠定了基礎。

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【部分圖文】：

圖1.敲除菌株的構建模型及鑒定圖譜

以BCG基因組為模板，PCR實驗擴增目的基因pknK，引物(表1)為pknK-F和pknK-R。使用限制性內切酶HpaI和HindIII對擴增產物和載體pMV361進行酶切，并連接酶切產物，轉化DH5α感受態(tài)細胞，LB培養(yǎng)基(卡那霉素50mg/L)培養(yǎng)。挑選單菌落進行基因測....

圖2.PknK負調控BCG的生長

獲得敲除菌株△pknK后，我們首先檢測了PknK對細菌的生長是否有影響�！鱬knK和BCG接種于7H9培養(yǎng)基中培養(yǎng)，每12h取樣測定OD600值。在前期48h，△pknK生長比BCG稍微有生長優(yōu)勢；在后期，與野生型BCG比，敲除菌株△pknK有明顯的生長優(yōu)勢；回補菌株pMV3....

圖3.PknK降低BCG的耐藥性

為了進一步了解PknK的生物功能，我們利用pulldown-MS的方法篩選與PknK蛋白相互作用的候選蛋白(圖4-A)。為了獲得直接與PknK相互作用的蛋白，我們在大腸桿菌中表達了PknK蛋白，與Ni-NTABeads孵育，用磷酸鹽緩沖液沖洗獲得Ni-NTAbeads-Pkn....

圖4.Pulldown-MS方法鑒定PknK互作蛋白

圖3.PknK降低BCG的耐藥性在質譜分析篩選出的靶標蛋白中，我們挑選了PknA與PknK進行了體外pulldown實驗驗證。首先，我們構建了PknA的表達質粒pGEX-5x-pknA，并轉化得到表達菌株。純化的GST-PknA與PknK-His混合孵育，用GST-tag進行p....

本文編號：4037456