短暫的心肌缺血可同時(shí)導(dǎo)致兩種不同的后果—心肌頓抑和缺血預(yù)適應(yīng)。這兩種現(xiàn)象的存在表明,當(dāng)受到缺血損傷刺激時(shí),心肌可調(diào)動(dòng)自身的內(nèi)源性保護(hù)系統(tǒng),適應(yīng)和抵抗損傷。揭示這種內(nèi)源性保護(hù)現(xiàn)象的分子機(jī)制,對(duì)缺血性心臟病的防治具有重要意義。短暫的心肌缺血-再灌注可以誘導(dǎo)許多具有細(xì)胞保護(hù)作用的基因表達(dá)上調(diào),這些表達(dá)上調(diào)的基因是心肌內(nèi)源性保護(hù)分子機(jī)制的重要組成部分。本文采用大鼠心肌短暫缺血-再灌注動(dòng)物模型,運(yùn)用抑制消減雜交方法,構(gòu)建了大鼠心肌短暫缺血-再灌注誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)基因的消減cDNA文庫(kù)。通過(guò)反向Northern點(diǎn)雜交從文庫(kù)中篩選了85個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì),獲得了31個(gè)已知基因和18個(gè)可能代表新基因的EST片段。從以上所獲的差異表達(dá)基因中任選5個(gè)進(jìn)行RT-PCR分析,任選兩個(gè)進(jìn)行Northern雜交分析,均證實(shí)其在缺血-再灌注組心肌組織中表達(dá)上調(diào)。在所篩到的31個(gè)已知基因中,多個(gè)基因已有文獻(xiàn)報(bào)道在心肌缺血-再灌注時(shí)表達(dá)上調(diào)并發(fā)揮心肌保護(hù)作用,另一些已知基因與心肌缺血-再灌注的關(guān)系至今未見(jiàn)報(bào)道。篩選得到的18個(gè)可能代表新基因的EST片段已在GenBank中登錄。對(duì)以上已知... 

【文章頁(yè)數(shù)】：118 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
縮寫(xiě)詞簡(jiǎn)表
中文摘要
英文摘要
前言
技術(shù)路線
第一章 采用抑制消減雜交技術(shù)篩選大鼠心肌短暫缺血-再灌注誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的基因
    一、 材料和方法
        1. 材料
            1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.2 試劑
            1.3 引物
        2. 方法
            2.1 大鼠心肌短暫缺血-再灌注動(dòng)物模型的建立
            2.2 總 RNA 的提取
            2.3 mRNA 的提取
            2.4 抑制消減雜交
                2.4.1 cDNA 第一鏈的合成
                2.4.2 cDNA 第二鏈的合成
                2.4.3 雙鏈cDNA 的 RsaⅠ酶切
                2.4.4 檢測(cè)子（tester）cDNA 的接頭連接
                2.4.5 連接效率的檢測(cè)
                2.4.6 消減雜交
                2.4.7 抑制性 PCR
                2.4.8 消減效率的檢測(cè)
                2.4.9 消減cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建
            2.5 反向 Northern 點(diǎn)雜交初步篩選差異表達(dá)基因
            2.6 測(cè)序與序列分析
            2.7 RT-PCR 進(jìn)一步鑒定差異表達(dá)
            2.8 Northern blot 進(jìn)一步鑒定差異表達(dá)
    二、 結(jié)果
        1. 總 RNA 及mRNA 的提取
        2. 雙鏈cDNA 的合成及RsaⅠ酶切
        3. 雙鏈cDNA 與接頭的連接效率檢測(cè)
        4. 消減 PCR 產(chǎn)物檢測(cè)
        5. 消減效率的檢測(cè)
        6. 大鼠心肌缺血-再灌注誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)基因的消減cDNA 文庫(kù)的構(gòu)建
        7. 反向 Northern 點(diǎn)雜交初步篩選差異表達(dá)基因
        8. 測(cè)序和序列分析
        9. RT-PCR 和 Northern blot 進(jìn)一步驗(yàn)證差異表達(dá)
    三、 討論
第二章 采用cDNA 微陣列結(jié)合聚類分析探討大鼠心肌短暫缺血-再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)基因表達(dá)譜的改變
    一、 材料和方法
        1. 材料
        2. 方法
            2.1 大鼠心肌短暫缺血-再灌注動(dòng)物模型的制備
            2.2 cDNA 芯片檢測(cè)與分析
            2.3 聚類分析
    二、 結(jié)果
        1 cDNA 芯片結(jié)果
        2. 聚類分析
    三、 討論
第三章 大鼠心肌短暫缺血-再灌注誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)的新基因 Mip1 的克隆和特性分析
    一、 材料和方法
        1. 材料
            1.1 載體和菌株
            1.2 試劑
            1.3 引物
        2. 方法
            2.1 EST 拼接
            2.2 電子克隆
            2.3 RACE 技術(shù)獲取基因5′末端
                2.3.1 cDNA 第一鏈的合成
                2.3.2 5′RACE 擴(kuò)增
                2.3.3 測(cè)序和拼接
            2.4 RT-PCR 驗(yàn)證所獲基因全長(zhǎng)
            2.5 多組織膜 Northern 雜交
            2.6 生物信息學(xué)分析 Mip1 的核酸和蛋白質(zhì)特性
    二、 結(jié)果
        1. EST 拼接與電子克隆
        2. 5′RACE 擴(kuò)增
        3. RT-PCR 驗(yàn)證所獲基因全長(zhǎng)
        4. 多組織膜 Northern 雜交結(jié)果
        5. Mip1 的核酸與蛋白質(zhì)特性的生物信息學(xué)分析
    三、 討論
第四章 新基因 Mip1 功能的初步研究
    一、 材料和方法
        1. 材料
            1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
            1.2 細(xì)胞
            1.3 載體和菌株
            1.4 試劑
        2. 方法
            2.1 大鼠心肌短暫缺血-再灌注動(dòng)物模型的制備
            2.2 Northern blot 檢測(cè)Mip1 在大鼠心肌短暫缺血-再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)
            2.3 Mip1 的真核表達(dá)質(zhì)粒Mip1-pEGFP-N1 和Mip1-pcDNA3.1/myc-His(-)的構(gòu)建
                2.3.1 加端 PCR 擴(kuò)增 Mip1 的 ORF
                2.3.2 PCR 產(chǎn)物及載體的酶切及回收
                2.3.3 連接與轉(zhuǎn)化
                2.3.4 質(zhì)粒 DNA 的小量制備
                2.3.5 Mip1-pEGFP-N1 和 Mip1-pcDNA3.1 重組子的鑒定
                2.3.6 質(zhì)粒 DNA 的大量制備
            2.4 Mip1 蛋白在正常和活性氧刺激時(shí)的亞細(xì)胞定位
            2.5 穩(wěn)定表達(dá) Mip1 的 C2C12細(xì)胞株的建立
                2.5.1 轉(zhuǎn)染和 G418 篩選
                2.5.2 Western blot 篩選高表達(dá)克隆
            2.6 H_2O_2濃度的測(cè)定
            2.7 H_2O_2損傷實(shí)驗(yàn)
            2.8 LDH 釋放率檢測(cè)
            2.9 Hoechst 33258 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)生率
            2.10 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Mip1對(duì)細(xì)胞周期的影響
            2.11 統(tǒng)計(jì)處理
    二、 結(jié)果
        1. Northern blot 檢測(cè)Mip1 在大鼠心肌短暫缺血-再灌注后不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)
        2. Mip1 蛋白在正常和活性氧刺激時(shí)的亞細(xì)胞定位
            2.1 Mip1-pEGFP-N1 重組質(zhì)粒的鑒定
            2.2 Mip1 蛋白在正常和氧化應(yīng)激時(shí)的亞細(xì)胞定位
        3. 穩(wěn)定表達(dá) Mip1 的 C_2C_(12)細(xì)胞株的建立
            3.1 Mip1-pcDNA3.1/myc-His(-)重組質(zhì)粒的鑒定
            3.2 Western blot 篩選高表達(dá) Mip1 的細(xì)胞克隆
        4. LDH 釋放率的測(cè)定
        5. Hoechst 33258 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡發(fā)生率
        6. 流式細(xì)胞術(shù)分析Mip1對(duì)細(xì)胞周期的影響
    三、討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
綜述1
綜述 2
攻讀學(xué)位期間主要的研究成果目錄
致謝


【參考文獻(xiàn)】：
期刊論文
[1]大鼠心肌缺血預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)基因的篩選和鑒定[J]. 袁燦,呂青蘭,陳廣文,劉瑛,王堯玲,劉海軍,鄒江,肖獻(xiàn)忠.  生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展. 2003(03)
[2]用cDNA芯片檢測(cè)大鼠心肌缺血預(yù)適應(yīng)后基因表達(dá)譜的改變[J]. 呂青蘭,袁燦,張華莉,陳廣文,王堯玲,鄧恭華,涂自智,肖獻(xiàn)忠.  中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志. 2003(03)



本文編號(hào)：3654273