短暫的心肌缺血可同時導致兩種不同的后果—心肌頓抑和缺血預適應。這兩種現(xiàn)象的存在表明,當受到缺血損傷刺激時,心肌可調動自身的內源性保護系統(tǒng),適應和抵抗損傷。揭示這種內源性保護現(xiàn)象的分子機制,對缺血性心臟病的防治具有重要意義。短暫的心肌缺血-再灌注可以誘導許多具有細胞保護作用的基因表達上調,這些表達上調的基因是心肌內源性保護分子機制的重要組成部分。本文采用大鼠心肌短暫缺血-再灌注動物模型,運用抑制消減雜交方法,構建了大鼠心肌短暫缺血-再灌注誘導表達上調基因的消減cDNA文庫。通過反向Northern點雜交從文庫中篩選了85個克隆進行測序。通過與GenBank數(shù)據(jù)庫進行序列比對,獲得了31個已知基因和18個可能代表新基因的EST片段。從以上所獲的差異表達基因中任選5個進行RT-PCR分析,任選兩個進行Northern雜交分析,均證實其在缺血-再灌注組心肌組織中表達上調。在所篩到的31個已知基因中,多個基因已有文獻報道在心肌缺血-再灌注時表達上調并發(fā)揮心肌保護作用,另一些已知基因與心肌缺血-再灌注的關系至今未見報道。篩選得到的18個可能代表新基因的EST片段已在GenBank中登錄。對以上已知... 

【文章頁數(shù)】：118 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
縮寫詞簡表
中文摘要
英文摘要
前言
技術路線
第一章 采用抑制消減雜交技術篩選大鼠心肌短暫缺血-再灌注誘導表達上調的基因
    一、 材料和方法
        1. 材料
            1.1 實驗動物
            1.2 試劑
            1.3 引物
        2. 方法
            2.1 大鼠心肌短暫缺血-再灌注動物模型的建立
            2.2 總 RNA 的提取
            2.3 mRNA 的提取
            2.4 抑制消減雜交
                2.4.1 cDNA 第一鏈的合成
                2.4.2 cDNA 第二鏈的合成
                2.4.3 雙鏈cDNA 的 RsaⅠ酶切
                2.4.4 檢測子（tester）cDNA 的接頭連接
                2.4.5 連接效率的檢測
                2.4.6 消減雜交
                2.4.7 抑制性 PCR
                2.4.8 消減效率的檢測
                2.4.9 消減cDNA 文庫的構建
            2.5 反向 Northern 點雜交初步篩選差異表達基因
            2.6 測序與序列分析
            2.7 RT-PCR 進一步鑒定差異表達
            2.8 Northern blot 進一步鑒定差異表達
    二、 結果
        1. 總 RNA 及mRNA 的提取
        2. 雙鏈cDNA 的合成及RsaⅠ酶切
        3. 雙鏈cDNA 與接頭的連接效率檢測
        4. 消減 PCR 產物檢測
        5. 消減效率的檢測
        6. 大鼠心肌缺血-再灌注誘導表達上調基因的消減cDNA 文庫的構建
        7. 反向 Northern 點雜交初步篩選差異表達基因
        8. 測序和序列分析
        9. RT-PCR 和 Northern blot 進一步驗證差異表達
    三、 討論
第二章 采用cDNA 微陣列結合聚類分析探討大鼠心肌短暫缺血-再灌注后不同時間點基因表達譜的改變
    一、 材料和方法
        1. 材料
        2. 方法
            2.1 大鼠心肌短暫缺血-再灌注動物模型的制備
            2.2 cDNA 芯片檢測與分析
            2.3 聚類分析
    二、 結果
        1 cDNA 芯片結果
        2. 聚類分析
    三、 討論
第三章 大鼠心肌短暫缺血-再灌注誘導表達上調的新基因 Mip1 的克隆和特性分析
    一、 材料和方法
        1. 材料
            1.1 載體和菌株
            1.2 試劑
            1.3 引物
        2. 方法
            2.1 EST 拼接
            2.2 電子克隆
            2.3 RACE 技術獲取基因5′末端
                2.3.1 cDNA 第一鏈的合成
                2.3.2 5′RACE 擴增
                2.3.3 測序和拼接
            2.4 RT-PCR 驗證所獲基因全長
            2.5 多組織膜 Northern 雜交
            2.6 生物信息學分析 Mip1 的核酸和蛋白質特性
    二、 結果
        1. EST 拼接與電子克隆
        2. 5′RACE 擴增
        3. RT-PCR 驗證所獲基因全長
        4. 多組織膜 Northern 雜交結果
        5. Mip1 的核酸與蛋白質特性的生物信息學分析
    三、 討論
第四章 新基因 Mip1 功能的初步研究
    一、 材料和方法
        1. 材料
            1.1 實驗動物
            1.2 細胞
            1.3 載體和菌株
            1.4 試劑
        2. 方法
            2.1 大鼠心肌短暫缺血-再灌注動物模型的制備
            2.2 Northern blot 檢測Mip1 在大鼠心肌短暫缺血-再灌注后不同時間點的表達
            2.3 Mip1 的真核表達質粒Mip1-pEGFP-N1 和Mip1-pcDNA3.1/myc-His(-)的構建
                2.3.1 加端 PCR 擴增 Mip1 的 ORF
                2.3.2 PCR 產物及載體的酶切及回收
                2.3.3 連接與轉化
                2.3.4 質粒 DNA 的小量制備
                2.3.5 Mip1-pEGFP-N1 和 Mip1-pcDNA3.1 重組子的鑒定
                2.3.6 質粒 DNA 的大量制備
            2.4 Mip1 蛋白在正常和活性氧刺激時的亞細胞定位
            2.5 穩(wěn)定表達 Mip1 的 C2C12細胞株的建立
                2.5.1 轉染和 G418 篩選
                2.5.2 Western blot 篩選高表達克隆
            2.6 H_2O_2濃度的測定
            2.7 H_2O_2損傷實驗
            2.8 LDH 釋放率檢測
            2.9 Hoechst 33258 染色檢測細胞凋亡發(fā)生率
            2.10 流式細胞術檢測Mip1對細胞周期的影響
            2.11 統(tǒng)計處理
    二、 結果
        1. Northern blot 檢測Mip1 在大鼠心肌短暫缺血-再灌注后不同時間點的表達
        2. Mip1 蛋白在正常和活性氧刺激時的亞細胞定位
            2.1 Mip1-pEGFP-N1 重組質粒的鑒定
            2.2 Mip1 蛋白在正常和氧化應激時的亞細胞定位
        3. 穩(wěn)定表達 Mip1 的 C_2C_(12)細胞株的建立
            3.1 Mip1-pcDNA3.1/myc-His(-)重組質粒的鑒定
            3.2 Western blot 篩選高表達 Mip1 的細胞克隆
        4. LDH 釋放率的測定
        5. Hoechst 33258 染色檢測細胞凋亡發(fā)生率
        6. 流式細胞術分析Mip1對細胞周期的影響
    三、討論
結論
參考文獻
綜述1
綜述 2
攻讀學位期間主要的研究成果目錄
致謝


【參考文獻】：
期刊論文
[1]大鼠心肌缺血預適應誘導表達上調基因的篩選和鑒定[J]. 袁燦,呂青蘭,陳廣文,劉瑛,王堯玲,劉海軍,鄒江,肖獻忠.  生物化學與生物物理進展. 2003(03)
[2]用cDNA芯片檢測大鼠心肌缺血預適應后基因表達譜的改變[J]. 呂青蘭,袁燦,張華莉,陳廣文,王堯玲,鄧恭華,涂自智,肖獻忠.  中國動脈硬化雜志. 2003(03)



本文編號：3654273