瘧疾仍然是危害人類健康的嚴重傳染病，有效的疫苗將為防止瘧原蟲感染、減少瘧疾發(fā)病和阻斷蚊媒傳播提供重要的手段。DNA疫苗是一種全新的疫苗形式，具有簡單、穩(wěn)定和靈活多樣的突出特點，可誘導包括細胞和抗體在內的多種免疫應答。細胞因子在免疫應答過程中具有重要的作用，編碼細胞因子的質粒DNA可有效促進和調節(jié)DNA疫苗所誘導的免疫應答。用DNA進行初始免疫，用重組蛋白或重組減毒痘病毒進行追加免疫的初始／強化免疫方案可選擇性地增強由DNA免疫所誘導的免疫應答，提高DNA疫苗的保護效能。AMA1是紅內期瘧疾疫苗的重要候選抗原，抗體在針對AMA1的保護性免疫中發(fā)揮著關鍵作用。本研究選擇AMA1的胞外域片段作為疫苗靶向，制備了包括重組蛋白、質粒DNA和重組MVA在內的三種不同形式的原型疫苗，在分析各種疫苗免疫特性的基礎上，采用DNA加細胞因子編碼質粒進行初始免疫，用重組蛋白和重組MVA按不同的順序進行追加強化，探討了不同免疫方案在增強小鼠抗AMA1抗體應答中的作用。 首先，自P.f基因組DNA中擴增出編碼AMA1胞外域的基因片段，經測序確證后，克隆入原核表達載體。構建了可分別表達AMA1完整胞外域蛋白... 

【文章來源】：中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學陜西省 211工程院校

【文章頁數】：96 頁

【學位級別】：博士

【文章目錄】：
目錄
英文縮寫詞注
摘要
前言
研究內容
    第一部分 重組AMA1蛋白的制備及其誘導的小鼠抗體應答
        一 材料與方法
            1 瘧原蟲的培養(yǎng)和基因組DNA的提取
            2 引物設計和PCR
            3 重組表達載體的構建和序列測定
            4 質粒和菌種
            5 重組表達產物的溶解性實驗
            6 包涵體蛋白的純化
            7 變性蛋白的重折疊復性
            8 小鼠免疫和抗體的檢測
            9 IFA和Western blot
            10 免疫血清的體外抑制實驗
        二 結果
            1 AMA1胞外域編碼基因的擴增和序列分析
            2 重組AMA1蛋白的表達和純化
            3 小鼠免疫血清的制備以及體外抑制實驗
        三 討論
    第二部分 細胞因子質粒對AMA1 DNA免疫的調節(jié)作用
        一 材料與方法
            1 AMA1 DNA免疫質粒的構建
            2 GM-CSF編碼序列的測定和表達載體的構建
            3 IL-4編碼序列的測定和表達載體的構建
            4 IL-12編碼質粒的酶切鑒定
            5 雙表達質粒pGM-CSF／pTPA-E的構建
            6 質粒的純化
            7 AMA1 DNA免疫的抗體動力學分析
            8 細胞因子質粒與VR1020／E的組合免疫
            9 脾細胞增殖實驗
        二 結果
            1 AMA1 DNA免疫質粒的構建
            2 小鼠細胞因子編碼序列的測定和表達質粒的構建
                2.1 小鼠細胞因子GM-CSF的序列分析和載體構建
                2.2 小鼠細胞因子IL-4的序列測定和載體構建
                2.3 pIL-12的酶切鑒定
                2.4 雙表達質粒pGM-CSF／pTPA-E的鑒定
            3 細胞因子對AMA1 DNA免疫的調節(jié)作用
                3.1 AMA1 DNA免疫的抗體動力學
                3.2 細胞因子表達質粒對DNA免疫應答的調節(jié)作用
                    3.2.1 IgG抗體的水平和類型
                    3.2.2 脾細胞的體外增殖
        三 討論
    第三部分 表達AMA1的重組MVA的篩選及小鼠免疫
        一 材料與方法
            1 基因轉移載體pⅢdHR.ssp/E的構建
            2 AMA1轉移載體與MVA的同源重組
            3 重組MVA的篩選
            4 重組MVA的鑒定
            5 重組病毒的擴增和滴度測定
            6 小鼠的免疫
        二 結果
            1 AMA1基因轉移載體的構建
            2 表達AMA1的重組MVA的篩選和鑒定
                2.1 MVA重組體的PCR鑒定
                2.2 AMA1在BHK21中的表達
                2.3 重組病毒rMVA/E的穩(wěn)定性
            3 重組MVA的免疫特性分析
                3.1 rMVA／E誘導小鼠抗AMA1抗體應答
                3.2 rMVA／E免疫小鼠的脾細胞增殖
        三 討論
    第四部分 以DNA為基礎的復合免疫接種誘導小鼠抗AMA1抗體應答
        一 材料與方法
            1 rMVA/E對DNA免疫小鼠抗體應答的增強作用
            2 重組蛋白強化與重組MVA強化的比較以及組合強化免疫
        二 結果
            1 rMVA／E對DNA免疫小鼠抗體應答的增強作用
            2 重組蛋白E與rMVA／E抗體強化作用的比較以及組合強化的效果
        三 討論
小結
文獻回顧
    一 DNA免疫的機制和優(yōu)化方法
    二 改良的安卡拉痘苗病毒（MVA）及其應用
    三 瘧原蟲頂端膜抗原1（AMA1）的研究概況
參考文獻
致謝
附錄: 研究生期間發(fā)表的論著



本文編號：3161716