瘧疾仍然是危害人類健康的嚴(yán)重傳染病，有效的疫苗將為防止瘧原蟲(chóng)感染、減少瘧疾發(fā)病和阻斷蚊媒傳播提供重要的手段。DNA疫苗是一種全新的疫苗形式，具有簡(jiǎn)單、穩(wěn)定和靈活多樣的突出特點(diǎn)，可誘導(dǎo)包括細(xì)胞和抗體在內(nèi)的多種免疫應(yīng)答。細(xì)胞因子在免疫應(yīng)答過(guò)程中具有重要的作用，編碼細(xì)胞因子的質(zhì)粒DNA可有效促進(jìn)和調(diào)節(jié)DNA疫苗所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答。用DNA進(jìn)行初始免疫，用重組蛋白或重組減毒痘病毒進(jìn)行追加免疫的初始／強(qiáng)化免疫方案可選擇性地增強(qiáng)由DNA免疫所誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，提高DNA疫苗的保護(hù)效能。AMA1是紅內(nèi)期瘧疾疫苗的重要候選抗原，抗體在針對(duì)AMA1的保護(hù)性免疫中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。本研究選擇AMA1的胞外域片段作為疫苗靶向，制備了包括重組蛋白、質(zhì)粒DNA和重組MVA在內(nèi)的三種不同形式的原型疫苗，在分析各種疫苗免疫特性的基礎(chǔ)上，采用DNA加細(xì)胞因子編碼質(zhì)粒進(jìn)行初始免疫，用重組蛋白和重組MVA按不同的順序進(jìn)行追加強(qiáng)化，探討了不同免疫方案在增強(qiáng)小鼠抗AMA1抗體應(yīng)答中的作用。 首先，自P.f基因組DNA中擴(kuò)增出編碼AMA1胞外域的基因片段，經(jīng)測(cè)序確證后，克隆入原核表達(dá)載體。構(gòu)建了可分別表達(dá)AMA1完整胞外域蛋白... 

【文章來(lái)源】：中國(guó)人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)陜西省 211工程院校

【文章頁(yè)數(shù)】：96 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：博士

【文章目錄】：
目錄
英文縮寫詞注
摘要
前言
研究?jī)?nèi)容
    第一部分 重組AMA1蛋白的制備及其誘導(dǎo)的小鼠抗體應(yīng)答
        一 材料與方法
            1 瘧原蟲(chóng)的培養(yǎng)和基因組DNA的提取
            2 引物設(shè)計(jì)和PCR
            3 重組表達(dá)載體的構(gòu)建和序列測(cè)定
            4 質(zhì)粒和菌種
            5 重組表達(dá)產(chǎn)物的溶解性實(shí)驗(yàn)
            6 包涵體蛋白的純化
            7 變性蛋白的重折疊復(fù)性
            8 小鼠免疫和抗體的檢測(cè)
            9 IFA和Western blot
            10 免疫血清的體外抑制實(shí)驗(yàn)
        二 結(jié)果
            1 AMA1胞外域編碼基因的擴(kuò)增和序列分析
            2 重組AMA1蛋白的表達(dá)和純化
            3 小鼠免疫血清的制備以及體外抑制實(shí)驗(yàn)
        三 討論
    第二部分 細(xì)胞因子質(zhì)粒對(duì)AMA1 DNA免疫的調(diào)節(jié)作用
        一 材料與方法
            1 AMA1 DNA免疫質(zhì)粒的構(gòu)建
            2 GM-CSF編碼序列的測(cè)定和表達(dá)載體的構(gòu)建
            3 IL-4編碼序列的測(cè)定和表達(dá)載體的構(gòu)建
            4 IL-12編碼質(zhì)粒的酶切鑒定
            5 雙表達(dá)質(zhì)粒pGM-CSF／pTPA-E的構(gòu)建
            6 質(zhì)粒的純化
            7 AMA1 DNA免疫的抗體動(dòng)力學(xué)分析
            8 細(xì)胞因子質(zhì)粒與VR1020／E的組合免疫
            9 脾細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
        二 結(jié)果
            1 AMA1 DNA免疫質(zhì)粒的構(gòu)建
            2 小鼠細(xì)胞因子編碼序列的測(cè)定和表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
                2.1 小鼠細(xì)胞因子GM-CSF的序列分析和載體構(gòu)建
                2.2 小鼠細(xì)胞因子IL-4的序列測(cè)定和載體構(gòu)建
                2.3 pIL-12的酶切鑒定
                2.4 雙表達(dá)質(zhì)粒pGM-CSF／pTPA-E的鑒定
            3 細(xì)胞因子對(duì)AMA1 DNA免疫的調(diào)節(jié)作用
                3.1 AMA1 DNA免疫的抗體動(dòng)力學(xué)
                3.2 細(xì)胞因子表達(dá)質(zhì)粒對(duì)DNA免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用
                    3.2.1 IgG抗體的水平和類型
                    3.2.2 脾細(xì)胞的體外增殖
        三 討論
    第三部分 表達(dá)AMA1的重組MVA的篩選及小鼠免疫
        一 材料與方法
            1 基因轉(zhuǎn)移載體pⅢdHR.ssp/E的構(gòu)建
            2 AMA1轉(zhuǎn)移載體與MVA的同源重組
            3 重組MVA的篩選
            4 重組MVA的鑒定
            5 重組病毒的擴(kuò)增和滴度測(cè)定
            6 小鼠的免疫
        二 結(jié)果
            1 AMA1基因轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建
            2 表達(dá)AMA1的重組MVA的篩選和鑒定
                2.1 MVA重組體的PCR鑒定
                2.2 AMA1在BHK21中的表達(dá)
                2.3 重組病毒rMVA/E的穩(wěn)定性
            3 重組MVA的免疫特性分析
                3.1 rMVA／E誘導(dǎo)小鼠抗AMA1抗體應(yīng)答
                3.2 rMVA／E免疫小鼠的脾細(xì)胞增殖
        三 討論
    第四部分 以DNA為基礎(chǔ)的復(fù)合免疫接種誘導(dǎo)小鼠抗AMA1抗體應(yīng)答
        一 材料與方法
            1 rMVA/E對(duì)DNA免疫小鼠抗體應(yīng)答的增強(qiáng)作用
            2 重組蛋白強(qiáng)化與重組MVA強(qiáng)化的比較以及組合強(qiáng)化免疫
        二 結(jié)果
            1 rMVA／E對(duì)DNA免疫小鼠抗體應(yīng)答的增強(qiáng)作用
            2 重組蛋白E與rMVA／E抗體強(qiáng)化作用的比較以及組合強(qiáng)化的效果
        三 討論
小結(jié)
文獻(xiàn)回顧
    一 DNA免疫的機(jī)制和優(yōu)化方法
    二 改良的安卡拉痘苗病毒（MVA）及其應(yīng)用
    三 瘧原蟲(chóng)頂端膜抗原1（AMA1）的研究概況
參考文獻(xiàn)
致謝
附錄: 研究生期間發(fā)表的論著



本文編號(hào)：3161716