蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是生命科學(xué)中的分析化學(xué)的主要內(nèi)容,是當(dāng)前的研究前沿,是化學(xué)生物學(xué)近年來的新研究方向。本論文工作是在建立蛋白質(zhì)組研究實驗室的過程中,建立和發(fā)展了蛋白質(zhì)組、比較蛋白質(zhì)組和定量蛋白質(zhì)組研究的相關(guān)技術(shù)平臺,并將其應(yīng)用于人類重大疾病的研究。 定量蛋白質(zhì)組學(xué)是通過某種方法或技術(shù),對生物樣品(細胞、組織或體液等)在某些過程中蛋白質(zhì)的含量進行比較分析。從蛋白質(zhì)組水平上對基因表達進行準(zhǔn)確的定量分析,是比較蛋白質(zhì)組學(xué)的重要內(nèi)容,是當(dāng)前研究重大疾病致病機制以及藥理控制機制的必要手段及研究前沿。 本論文工作的主要貢獻是,建立了一套穩(wěn)定可靠的蛋白質(zhì)順序提取-雙向凝膠電泳分離-半自動膠上酶解-質(zhì)譜鑒定的高通量技術(shù)分析平臺;建立了一種新的、基于肽段乙�；姆�(wěn)定同位素標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組分析技術(shù),并在實際生物樣品體系中進行了驗證;將建立、優(yōu)化的蛋白質(zhì)組定量分析技術(shù)應(yīng)用于動脈粥樣硬化、冠心病以及肝癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移相關(guān)的多個實際生物樣品的比較分析,并從分子水平上評價了幾種藥物的藥效。本文還研究了對基于生物素-抗生物素蛋白特異性結(jié)合的親和色譜分離體系,結(jié)果顯示該體系有望實現(xiàn)與乙酰基化同位素標(biāo)記技術(shù)的有效對接,建立新的定量分析技術(shù)。 一、在優(yōu)化和發(fā)展傳統(tǒng)雙向凝膠電泳蛋白質(zhì)組、比較蛋白質(zhì)組方法的基礎(chǔ)上,建立了蛋白質(zhì)組順序提取-雙向凝膠電泳分離-半自動膠上酶解-質(zhì)譜鑒定的高通量技術(shù)分析平臺,為蛋白質(zhì)組學(xué)方法學(xué)研究和應(yīng)用研究奠定了實驗基礎(chǔ) 鑒于蛋白質(zhì)組的高度復(fù)雜性,在進行雙向凝膠電泳前對蛋白質(zhì)進行預(yù)分組是十分必要的。順序提取按蛋白質(zhì)溶解能力的不同將復(fù)雜的蛋白質(zhì)組預(yù)分組,是目前常用的比較有效的樣品預(yù)分組的方法之一。如何根據(jù)實驗需求合理選擇不同溶解能力的順序提取液,不同的蛋白質(zhì)提取液可否直接進行雙向凝膠電泳分離并得到良好的分離效果等問題,是影響蛋白質(zhì)組分析的重要因素。 本論文提出了一套完整的蛋白質(zhì)三步提取方案,可以確保幾乎所有的蛋白質(zhì)進入相應(yīng)的溶液中。其中,T1體系 (1 mmol/L PMSF的水溶液) 由于不含任何的蛋白質(zhì)去垢劑、變性劑等,背景溶液組成簡單,可以很方便地采取各種色譜分離的手段進行分離,也可以在直接補加一定量的蛋白質(zhì)去垢劑、變性劑后采用雙向凝膠電泳進行分離;T2 (7 mol/L 尿素,2 mol/L硫脲,2% CHAPS,2% SB3-10, WP=7 50 mmol/L DTT,1 mmol/L PMSF) 背景溶液的組成與雙向凝膠電泳分離的緩沖體系相容性較好,因此可以利用雙向凝膠電泳優(yōu)越的分離能力和直觀的檢測方式直接對E2進行分離分析。由于高豐度蛋白質(zhì)多存在于胞漿中,可溶性較好,E2中大量高豐度蛋白質(zhì)已被提取,間接提高了上樣量,使一些中、低豐度的蛋白質(zhì)得到檢測,提高了蛋白質(zhì)的檢出率;在T2提取液的組成中加入離子性去垢劑SDS作為第三級提取液T3,將T2提取后的不溶物基本上全部溶解,同時由于SDS的存在,稀釋不會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的析出,通過稀釋,可以直接采取多維色譜進行分離分析。 作為該平臺中聯(lián)系雙向凝膠電泳分離和質(zhì)譜鑒定的橋梁,膠內(nèi)酶解過程是影響肽段回收率的主要因素。本論文將原手工膠上酶解過程經(jīng)適當(dāng)調(diào)整,應(yīng)用于高通量半自動酶解分析,提高了分析速度和通量;實驗考察了對半自動膠上酶解過程中嚴重影響肽段回收率和蛋白質(zhì)鑒定的確定性的諸多環(huán)節(jié),包括酶液使用量的多少、酶解時間的長短、是否去鹽等問題,優(yōu)化了實驗參數(shù)。即當(dāng)用96孔板酶解一粒直徑1.4 mm的膠粒時,使用3 ?l的胰蛋白酶液(12.5 ng/?l)足以使其完全酶解,酶解時間長(酶解過夜)有助于得到較多的肽段,膠上酶解所得的肽段是否去鹽對質(zhì)譜分析所得的譜圖質(zhì)量的影響,主要取決于肽段溶液中含鹽量及溶液中肽段的相對多少等等。 二、雙向凝膠電泳-質(zhì)譜鑒定定量蛋白質(zhì)組學(xué)在疾病研究中的應(yīng)用 本論文應(yīng)用雙向凝膠電泳-質(zhì)譜鑒定比較蛋白質(zhì)組的方法對心血管、肝癌等兩類重大疾病相關(guān)的細胞系或組織的蛋白質(zhì)組進行了比較分析,奠定了致病過程中關(guān)鍵蛋白質(zhì)篩選的基礎(chǔ),結(jié)果對藥物的研發(fā)、藥效的評價也具有指導(dǎo)意義。 1、動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)泡沫細胞模型比較蛋白質(zhì)組研究。AS是心腦血管疾病的共同病理基礎(chǔ),而泡沫細胞是AS斑塊內(nèi)出現(xiàn)的特征性病理細胞。AS早期,單核細胞首先粘附于血管內(nèi)皮,然后遷移至內(nèi)皮下分化為巨噬細胞,后者主要通過清道夫受體無節(jié)制地吞噬大量氧化低密度脂蛋白(ox-LDL),形成巨噬源性泡沫細胞,進而堆積成AS斑塊。 利用雙向凝膠電泳對正常巨噬細胞、泡沫細胞進行了差異蛋白質(zhì)組分析。對其中26個高表達蛋白質(zhì)點及11個差異蛋白質(zhì)點進行手工膠上酶解,1D LC-ESI/MS鑒定;對鑒定出的差異蛋白質(zhì)按功能進行了歸類,并討論了其在泡沫細胞形成過程中可能的作用。研究了具有抗AS功效的銀杏葉提取物(GbE)、香豆素提取單體(IMP)作用后泡沫細胞蛋白質(zhì)組的變化情況。通過比較分析雙向凝膠電泳分離所得的圖譜,發(fā)現(xiàn)兩種藥物對差異蛋白質(zhì)皆有一定的回調(diào)作用,但 WP=8 回調(diào)的蛋白質(zhì)種類和程度卻不完全相同,提示兩種藥物的抗AS作用在機制上存在差異。本工作用雙向凝膠電泳分離技術(shù)成功地篩選并確定了不同藥物的作用靶點。 2、冠心病(Coronary Heart Disease, CHD)家兔主動脈血管、肝臟組
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R341
【部分圖文】：

復(fù)旦大學(xué)博士論文和自動化，故難以適應(yīng)大規(guī)模、高通量分析的要求（二）穩(wěn)定同位素標(biāo)記定量分析技術(shù)穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)（isotope labeling techniq較新也是比較準(zhǔn)確可靠的定量分析方法。由于質(zhì)譜分析過程中，肽段的離子化效率隨時采用內(nèi)標(biāo)法補償這種變化，以獲得較為可靠的定量

以致峰的間距就會越大。通過比較質(zhì)譜圖中含有同位素標(biāo)一對峰的相對強度，就可以判斷出原細胞體系中某蛋白質(zhì)表達水平的由分析原理和過程可知，該方法只是對氨基酸序列已知的肽段的分，對于未知序列肽段，由于無法得知分析肽段中確切的氨基酸的數(shù)目此難以確定其中所含氮原子的確切數(shù)目，故識別質(zhì)譜圖中一對分析對較困難，這也是該標(biāo)記技術(shù)比較明顯的缺點之一。．使用穩(wěn)定同位素標(biāo)記的氨基酸殘基的細胞培養(yǎng)介質(zhì)該技術(shù)又稱為穩(wěn)定同位素標(biāo)記氨基酸介質(zhì)細胞培養(yǎng)技術(shù)（SILAotope Labeling by Amino Acids in Cell Culture），是使用含有穩(wěn)定同位過的某種氨基酸殘基的介質(zhì)培養(yǎng)細胞，將穩(wěn)定同位素（2H,13C,15N）氨基酸（如賴氨酸 Lys、半胱氨酸 Cys、或絲氨酸 Ser 等）在細胞培引入到細胞生長過程中所表達的蛋白質(zhì)的氨基酸骨架結(jié)構(gòu)中。這一技點是，在用生物質(zhì)譜進行蛋白質(zhì)鑒定定量分析的同時，還能夠提供蛋

碘代乙�；c巰基的特異性取代反應(yīng)與蛋白質(zhì)中半胱代反應(yīng)，將同位素原子結(jié)合到含有半胱氨酸的肽段中。由 個氘原子取代部分，還存在生物素（biotin）部分，因此白質(zhì)半胱氨酸中巰基部分的同位素標(biāo)記，還可以通過基合的親和色譜分離技術(shù)實現(xiàn)對已經(jīng)標(biāo)記過的含有半胱氨離，使分析、分離過程簡化 從而減少了過程誤差。具有廣泛的兼容性，主要表現(xiàn)在：第一，能夠兼容分、組織中絕大部分蛋白質(zhì)；第二，烷基化反應(yīng)即使在鹽鹽酸胍等)、蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑存在下都可以進行；第三，基的肽段，從而降低了蛋白質(zhì)混合物分析體系的復(fù)雜性何類型的生化、免疫、物理的分離方法，因此允許使用在理論上能很好地定量分析低豐度的蛋白質(zhì)。圖 1-4 ICAT 試劑化學(xué)結(jié)構(gòu)
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9 白麗;生物素化抗細胞因子單克隆抗體的制備[J];免疫學(xué)雜志;2001年03期

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本文編號：2882877