自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(natural regulatory T cells, nTregs)調(diào)節(jié)生理及病理情況下機(jī)體的免疫應(yīng)答,對(duì)于維持機(jī)體自身免疫耐受及免疫自穩(wěn)具有重要作用。Foxp3在nTregs中高表達(dá),是nTregs發(fā)生、發(fā)育及功能發(fā)揮必不可少的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。同時(shí)Foxp3與其他T細(xì)胞如Th1、 Th17等的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子相互作用,與它們的分化發(fā)育存在密切的相關(guān)性,參與了臨床各種免疫疾病的病理過程。 HIV-Tat蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)結(jié)構(gòu)域(protein transduction domains, PTD)能將外源性的生物分子帶入細(xì)胞內(nèi),甚至核內(nèi),但對(duì)細(xì)胞無毒副作用,已廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究中,是生物醫(yī)藥重要的給藥載體,為生命科學(xué)研究領(lǐng)域提供了新的工具。 目的：研究PTD-Foxp3融合蛋白的生物學(xué)功能,觀察其對(duì)Tregs、Th17、Th1等亞群分化的調(diào)節(jié)作用及對(duì)免疫相關(guān)性疾病的治療作用,為最終應(yīng)用于臨床器官移植及自身免疫病等免疫相關(guān)性疾病的治療提供理論和實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。 方法： (1)人淋巴瘤細(xì)胞系Jurkat或從外周血分離人PBMCs和CD4+CD25-T細(xì)胞,經(jīng)融合蛋白PTD-人FOXP3(PTD-hFOXP3)處理后,分別采用CCK-8法檢測(?)JCD4+CD25-T細(xì)胞活化增殖能力及蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+CD25T細(xì)胞對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的增殖抑制能力：RT-PCR檢測IL-2、INF-γ、IL-10、IL-4、TGF-β和CTLA-4的mRNA表達(dá)水平；ELISA測定上清中IL-2、INF-γ、IL-10和TGF-β的分泌水平及流式細(xì)胞術(shù)檢測CD25和CTLA-4蛋白水平的表達(dá)；同時(shí)用CCK-8法檢測(?)JPTD-hFOXP3對(duì)雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)(MLR)的抑制作用；最后采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實(shí)驗(yàn)檢測(?)JFOXP3在IL-2啟動(dòng)子區(qū)的富集情況； (2)體外觀察融合蛋白PTD-小鼠Foxp3(PTD-mFoxp3)對(duì)小鼠Th1和Th17分化的調(diào)節(jié)。分離CD4+T細(xì)胞,經(jīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)Th1、Thl7,加入PTD-mFoxp3處理,再采用定量PCR和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測INF-γ、T-bet、IL-17A、RORyt mRNA表達(dá)水平(?)(?)NF-γ、IL-17A(?)的蛋白表達(dá)水平變化來評(píng)價(jià)PTD-mFoxp3對(duì)這兩種T細(xì)胞亞群分化的影響； (3)采用PTD-mFoxp3治療OVA誘導(dǎo)的遲發(fā)性超敏反應(yīng)(Delayed hypersensitivity reaction, DTH)模型小鼠局部,通過觀察耳廓腫脹程度,組織切片的組織病理變化,脾細(xì)胞對(duì)OVA的應(yīng)答能力,耳廓局部組織及引流淋巴結(jié)分泌INF-γ能力等指標(biāo)來觀察PTD-mFoxp3對(duì)Th1介導(dǎo)的DTH的治療作用。 結(jié)果： (1) PTD-hFOXP3能明顯抑制CD4+CD25-T細(xì)胞的活化增殖,且其轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4+CD25-T細(xì)胞能抑制CD3/CD28抗體活化的CD4+CD25-效應(yīng)T細(xì)胞增殖;RT-PCR\ELISA及FCM結(jié)果表明PTD-hFOXP3明顯下調(diào)IL-2與IFN-γ的表達(dá),而上調(diào)IL-4、IL-10、TGF-β和CTLA-4的表達(dá)；PTD-hFOXP3還能抑制雙向MLR; ChIP結(jié)果顯示FOXP3富集于IL-2啟動(dòng)子區(qū)； (2)體外在重組細(xì)胞因子及CD3/CD28抗體誘導(dǎo)條件下,CD4+T細(xì)胞可以向Th1、Th17方向分化；在Th1極化條件下,經(jīng)PTD-mFoxp3處理后,IFN-γ與T-bet mRNA表達(dá)水平明顯下降,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示IFN-γ+CD4+T細(xì)胞比率也明顯降低；在Th17極化條件下,PTD-mFoxp3能下調(diào)IL-17A與RORyt的mRNA表達(dá)水平及IL-17A的蛋白表達(dá)水平； (3)耳局部給予PTD-mFoxp3治療DTH模型小鼠,可以明顯減輕耳廓的腫脹程度,改善耳廓局部組織炎癥情況；耳局部引流淋巴結(jié)細(xì)胞分泌IFN-γ水平降低,而Foxp3表達(dá)水平上調(diào)。 結(jié)論：PTD-hFOXP3可以將CD4+CD25T細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Treg樣細(xì)胞；PTD-mFoxp3抑制了CD4+T細(xì)胞體外向Th1、Th17方向分化,且可有效抑制小鼠DTH的發(fā)生發(fā)展,因止(?)PTD-hFOXP3/mFoxp3對(duì)Th1和Th17細(xì)胞亞群的分化具有負(fù)向調(diào)控作用,為最終PTD-FOXP3應(yīng)用于移植排斥和自身免疫病等臨床疾病的治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R392
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells,Tregs）
        1.1.1 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分類
+CD25⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特點(diǎn)及功能'>        1.1.2 CD4⁺CD25⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞特點(diǎn)及功能
+CD25⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與臨床疾病'>        1.1.3 CD4⁺CD25⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞與臨床疾病
+CD25⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞體外誘導(dǎo)擴(kuò)增'>        1.1.4 CD4⁺CD25⁺調(diào)節(jié)性T細(xì)胞體外誘導(dǎo)擴(kuò)增
    1.2 Foxp3
        1.2.1 Fox家族與Foxp3
        1.2.2 Foxp3與Tregs
        1.2.3 Foxp3、RORγt和Tregs與Th17的平衡
        1.2.4 Foxp3和Th1
    1.3 PTD簡介
        1.3.1 蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域的來源與TAT-PTD結(jié)構(gòu)特點(diǎn)
        1.3.2 PTD作用特點(diǎn)及機(jī)制
        1.3.3 PTD的應(yīng)用
第二章 研究目的、方法、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案和意義
    2.1 研究目的
    2.2 研究方法及實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案
    2.3 本研究的意義
+CD25^-T細(xì)胞為Treg樣細(xì)胞'>第三章 PTD-hFOXP3誘導(dǎo)CD4⁺CD25^-T細(xì)胞為Treg樣細(xì)胞
    3.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和質(zhì)粒
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 主要溶液
    3.2 方法
        3.2.1 pET28a-PTD-hFOXP3,pET28a-hFOXP3和pET28a-PTD-eGFP融合蛋白的制備
            3.2.1.1 Rosetta感受態(tài)的制備
            3.2.1.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
            3.2.1.3 融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)
            3.2.1.4 融合蛋白的純化
            3.2.1.5 融合蛋白的脫鹽
            3.2.1.6 融合蛋白去內(nèi)毒素
            3.2.1.7 融合蛋白的SDS-PAGE電泳
        3.2.2 PTD-hFOXP3的細(xì)胞增殖抑制實(shí)驗(yàn)
            3.2.2.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC）的分離
+T,CD4⁺CD25^-T,CD4⁺CD25⁺T細(xì)胞'>            3.2.2.2 磁珠法分離人CD4⁺T,CD4⁺CD25^-T,CD4⁺CD25⁺T細(xì)胞
            3.2.2.3 刺激劑濃度的確定
            3.2.2.4 細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)
+CD25^-T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子及CTLA-4 mRNA表達(dá)水平的檢測'>        3.2.3 CD4⁺CD25^-T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子及CTLA-4 mRNA表達(dá)水平的檢測
            3.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建
            3.2.3.2 定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
+CD25^-T細(xì)胞活化不同時(shí)間的細(xì)胞因子分泌譜'>            3.2.3.3 CD4⁺CD25^-T細(xì)胞活化不同時(shí)間的細(xì)胞因子分泌譜
+CD25^-T細(xì)胞的細(xì)胞因子及CTLA-4mRNA表達(dá)水平的作用'>            3.2.3.4 PTD-hFOXP3對(duì)CD4⁺CD25^-T細(xì)胞的細(xì)胞因子及CTLA-4mRNA表達(dá)水平的作用
+CD25^T細(xì)胞的CTLA-4蛋白水平的檢測'>        3.2.4 PBMCs分泌的細(xì)胞因子及CD4⁺CD25^T細(xì)胞的CTLA-4蛋白水平的檢測
            3.2.4.1 標(biāo)本的收集
            3.2.4.2 ELISA檢測標(biāo)本
            3.2.4.3 Flow cytomctry檢測CTLA-4蛋白水平的檢測
+CD25^-T細(xì)胞的免疫抑制實(shí)驗(yàn)'>        3.2.5 PTD-hFOXP3轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4⁺CD25^-T細(xì)胞的免疫抑制實(shí)驗(yàn)
        3.2.6 雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）
        3.2.7 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）
        3.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        3.3.1 成功制備PTD-hFOXP3、hFOXP3和PTD-eGFP融合蛋白
        3.3.2 確定T細(xì)胞活化條件
+CD25^-T細(xì)胞的增殖'>        3.3.3 PTD-hFOXP3抑制活化CD4⁺CD25^-T細(xì)胞的增殖
+CD25^-T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子及CTLA-4表達(dá)的影響'>        3.3.4 PTD-hFOXP3對(duì)CD4⁺CD25^-T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子及CTLA-4表達(dá)的影響
            3.3.4.1 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建
+CD25^-T細(xì)胞活化不同時(shí)間細(xì)胞因子及CTLA-4表達(dá)情況'>            3.3.4.2 CD4⁺CD25^-T細(xì)胞活化不同時(shí)間細(xì)胞因子及CTLA-4表達(dá)情況
+CD25^-T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子及CTLA-4在mRNA水平上的影響'>            3.3.4.3 融合蛋白對(duì)CD4⁺CD25^-T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子及CTLA-4在mRNA水平上的影響
            3.3.4.4 ELISA檢測融合蛋白對(duì)PBMC分泌的細(xì)胞因子在蛋白水平上的影響
            3.3.4.5 Flow cytometry檢測CTLA-4蛋白水平的檢測
+CD25^-T細(xì)胞對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的增殖抑制作用'>        3.3.5 PTD-hFOXP3轉(zhuǎn)導(dǎo)的CD4⁺CD25^-T細(xì)胞對(duì)效應(yīng)細(xì)胞的增殖抑制作用
        3.3.6 PTD-hFOXP3抑制雙向混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)（MLR）
+CD25^-T細(xì)胞的IL-2啟動(dòng)子而下調(diào)其表達(dá)'>        3.3.7 PTD-hFOXP3能夠直接結(jié)合CD4⁺CD25^-T細(xì)胞的IL-2啟動(dòng)子而下調(diào)其表達(dá)
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 PTD-mFoxp3對(duì)Th17、Th1體外分化的影響
    4.1 材料
        4.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株和質(zhì)粒
        4.1.2 主要試劑及儀器
    4.2 方法
        4.2.1 PTD-mFoxp3與mFoxp3融合蛋白的制備
+T細(xì)胞'>        4.2.2 磁珠法分離小鼠CD4⁺T細(xì)胞
            4.2.2.1 準(zhǔn)備工作
            4.2.2.2 洗磁珠
+T細(xì)胞'>            4.2.2.3 陰性分選小鼠CD4⁺T細(xì)胞
        4.2.3 體外誘導(dǎo)鼠Th17的分化
        4.2.4 定量PCR檢測mouse IL-17A和mouse RORγt在mRNA水平的表達(dá)
        4.2.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測胞內(nèi)mouse IL-17A的表達(dá)
        4.2.6 ELISA方法檢測mouse IL-17A的表達(dá)
        4.2.7 PTD-mFoxp3對(duì)鼠Th1體外分化的影響
        4.2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        4.3.1 成功制備PTD-mFoxp3與mFoxp3融合蛋白
        4.3.2 鼠IL-17A和RORγt標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.3 鼠Th17體外分化條件的摸索
        4.3.4 定量PCR檢測PTD-mFoxp3對(duì)IL-17A和RORγt mRNA表達(dá)水平的影響
        4.3.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測PTD-mFoxp3對(duì)IL-17A蛋白表達(dá)變化的影響
        4.3.6 ELISA檢測PTD-mFoxp3對(duì)IL-17A蛋白表達(dá)變化的影響
        4.3.7 鼠IFN-γ和T-bet標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.8 PTD-mFoxp3對(duì)IFN-γ和T-bet mRNA表達(dá)水平的影響
        4.3.9 PTD-mFoxp3對(duì)IFN-γ和T-bet蛋白水平的影響
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 PTD-mFoxp3對(duì)小鼠遲發(fā)型超敏反應(yīng)的治療作用及其初步機(jī)制研究
    5.1 材料
        5.1.1 主要試劑及儀器
        5.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物
    5.2 方法
        5.2.1 DTH模型的建立
        5.2.2 PTD-mFoxp3的治療
        5.2.3 觀測指標(biāo)
            5.2.3.1 小鼠一般情況
            5.2.3.2 小鼠耳廓腫脹程度
            5.2.3.3 小鼠耳片重量差
            5.2.3.4 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)
            5.2.3.5 小鼠耳廓局部組織變化
            5.2.3.6 小鼠脾臟細(xì)胞的增殖活性
            5.2.3.7 耳引流淋巴結(jié)中Tregs和Th1細(xì)胞的分布
            5.2.3.8 耳片組織中IFN-γ與T-bet的表達(dá)
            5.2.3.9 淋巴結(jié)細(xì)胞與脾細(xì)胞培養(yǎng)上清IFN-γ的檢測
        5.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
    5.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
        5.3.1 成功復(fù)制了DTH模型
        5.3.2 PTD-mFoxp3對(duì)DTH小鼠的治療作用
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
第六章 主要結(jié)論及展望
    6.1 主要結(jié)論
    6.2 展望
參考文獻(xiàn)
致謝
攻讀博士學(xué)位發(fā)表的學(xué)術(shù)論文及其他科研成果

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本文編號(hào)：2877105