自然調(diào)節(jié)性T細胞(natural regulatory T cells, nTregs)調(diào)節(jié)生理及病理情況下機體的免疫應答,對于維持機體自身免疫耐受及免疫自穩(wěn)具有重要作用。Foxp3在nTregs中高表達,是nTregs發(fā)生、發(fā)育及功能發(fā)揮必不可少的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子。同時Foxp3與其他T細胞如Th1、 Th17等的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子相互作用,與它們的分化發(fā)育存在密切的相關(guān)性,參與了臨床各種免疫疾病的病理過程。 HIV-Tat蛋白轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域(protein transduction domains, PTD)能將外源性的生物分子帶入細胞內(nèi),甚至核內(nèi),但對細胞無毒副作用,已廣泛地應用于基礎(chǔ)研究中,是生物醫(yī)藥重要的給藥載體,為生命科學研究領(lǐng)域提供了新的工具。 目的：研究PTD-Foxp3融合蛋白的生物學功能,觀察其對Tregs、Th17、Th1等亞群分化的調(diào)節(jié)作用及對免疫相關(guān)性疾病的治療作用,為最終應用于臨床器官移植及自身免疫病等免疫相關(guān)性疾病的治療提供理論和實驗室依據(jù)。 方法： (1)人淋巴瘤細胞系Jurkat或從外周血分離人PBMCs和CD4+CD25-T細胞,經(jīng)融合蛋白PTD-人FOXP3(PTD-hFOXP3)處理后,分別采用CCK-8法檢測(?)JCD4+CD25-T細胞活化增殖能力及蛋白轉(zhuǎn)導的CD4+CD25T細胞對效應細胞的增殖抑制能力：RT-PCR檢測IL-2、INF-γ、IL-10、IL-4、TGF-β和CTLA-4的mRNA表達水平；ELISA測定上清中IL-2、INF-γ、IL-10和TGF-β的分泌水平及流式細胞術(shù)檢測CD25和CTLA-4蛋白水平的表達；同時用CCK-8法檢測(?)JPTD-hFOXP3對雙向混合淋巴細胞反應(MLR)的抑制作用；最后采用染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)實驗檢測(?)JFOXP3在IL-2啟動子區(qū)的富集情況； (2)體外觀察融合蛋白PTD-小鼠Foxp3(PTD-mFoxp3)對小鼠Th1和Th17分化的調(diào)節(jié)。分離CD4+T細胞,經(jīng)細胞因子誘導Th1、Thl7,加入PTD-mFoxp3處理,再采用定量PCR和流式細胞術(shù)分別檢測INF-γ、T-bet、IL-17A、RORyt mRNA表達水平(?)(?)NF-γ、IL-17A(?)的蛋白表達水平變化來評價PTD-mFoxp3對這兩種T細胞亞群分化的影響； (3)采用PTD-mFoxp3治療OVA誘導的遲發(fā)性超敏反應(Delayed hypersensitivity reaction, DTH)模型小鼠局部,通過觀察耳廓腫脹程度,組織切片的組織病理變化,脾細胞對OVA的應答能力,耳廓局部組織及引流淋巴結(jié)分泌INF-γ能力等指標來觀察PTD-mFoxp3對Th1介導的DTH的治療作用。 結(jié)果： (1) PTD-hFOXP3能明顯抑制CD4+CD25-T細胞的活化增殖,且其轉(zhuǎn)導的CD4+CD25-T細胞能抑制CD3/CD28抗體活化的CD4+CD25-效應T細胞增殖;RT-PCR\ELISA及FCM結(jié)果表明PTD-hFOXP3明顯下調(diào)IL-2與IFN-γ的表達,而上調(diào)IL-4、IL-10、TGF-β和CTLA-4的表達；PTD-hFOXP3還能抑制雙向MLR; ChIP結(jié)果顯示FOXP3富集于IL-2啟動子區(qū)； (2)體外在重組細胞因子及CD3/CD28抗體誘導條件下,CD4+T細胞可以向Th1、Th17方向分化；在Th1極化條件下,經(jīng)PTD-mFoxp3處理后,IFN-γ與T-bet mRNA表達水平明顯下降,流式細胞術(shù)結(jié)果顯示IFN-γ+CD4+T細胞比率也明顯降低；在Th17極化條件下,PTD-mFoxp3能下調(diào)IL-17A與RORyt的mRNA表達水平及IL-17A的蛋白表達水平； (3)耳局部給予PTD-mFoxp3治療DTH模型小鼠,可以明顯減輕耳廓的腫脹程度,改善耳廓局部組織炎癥情況；耳局部引流淋巴結(jié)細胞分泌IFN-γ水平降低,而Foxp3表達水平上調(diào)。 結(jié)論：PTD-hFOXP3可以將CD4+CD25T細胞轉(zhuǎn)化為Treg樣細胞；PTD-mFoxp3抑制了CD4+T細胞體外向Th1、Th17方向分化,且可有效抑制小鼠DTH的發(fā)生發(fā)展,因止(?)PTD-hFOXP3/mFoxp3對Th1和Th17細胞亞群的分化具有負向調(diào)控作用,為最終PTD-FOXP3應用于移植排斥和自身免疫病等臨床疾病的治療提供了實驗基礎(chǔ)。
【學位單位】：江蘇大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R392
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
第一章 緒論
    1.1 調(diào)節(jié)性T細胞（Regulatory T cells,Tregs）
        1.1.1 調(diào)節(jié)性T細胞的分類
+CD25⁺調(diào)節(jié)性T細胞特點及功能'>        1.1.2 CD4⁺CD25⁺調(diào)節(jié)性T細胞特點及功能
+CD25⁺調(diào)節(jié)性T細胞與臨床疾病'>        1.1.3 CD4⁺CD25⁺調(diào)節(jié)性T細胞與臨床疾病
+CD25⁺調(diào)節(jié)性T細胞體外誘導擴增'>        1.1.4 CD4⁺CD25⁺調(diào)節(jié)性T細胞體外誘導擴增
    1.2 Foxp3
        1.2.1 Fox家族與Foxp3
        1.2.2 Foxp3與Tregs
        1.2.3 Foxp3、RORγt和Tregs與Th17的平衡
        1.2.4 Foxp3和Th1
    1.3 PTD簡介
        1.3.1 蛋白轉(zhuǎn)導域的來源與TAT-PTD結(jié)構(gòu)特點
        1.3.2 PTD作用特點及機制
        1.3.3 PTD的應用
第二章 研究目的、方法、實驗設計方案和意義
    2.1 研究目的
    2.2 研究方法及實驗設計方案
    2.3 本研究的意義
+CD25^-T細胞為Treg樣細胞'>第三章 PTD-hFOXP3誘導CD4⁺CD25^-T細胞為Treg樣細胞
    3.1 實驗材料
        3.1.1 實驗菌株和質(zhì)粒
        3.1.2 主要試劑
        3.1.3 主要儀器
        3.1.4 主要溶液
    3.2 方法
        3.2.1 pET28a-PTD-hFOXP3,pET28a-hFOXP3和pET28a-PTD-eGFP融合蛋白的制備
            3.2.1.1 Rosetta感受態(tài)的制備
            3.2.1.2 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化
            3.2.1.3 融合蛋白的誘導表達
            3.2.1.4 融合蛋白的純化
            3.2.1.5 融合蛋白的脫鹽
            3.2.1.6 融合蛋白去內(nèi)毒素
            3.2.1.7 融合蛋白的SDS-PAGE電泳
        3.2.2 PTD-hFOXP3的細胞增殖抑制實驗
            3.2.2.1 外周血單個核細胞（PBMC）的分離
+T,CD4⁺CD25^-T,CD4⁺CD25⁺T細胞'>            3.2.2.2 磁珠法分離人CD4⁺T,CD4⁺CD25^-T,CD4⁺CD25⁺T細胞
            3.2.2.3 刺激劑濃度的確定
            3.2.2.4 細胞增殖抑制試驗
+CD25^-T細胞分泌的細胞因子及CTLA-4 mRNA表達水平的檢測'>        3.2.3 CD4⁺CD25^-T細胞分泌的細胞因子及CTLA-4 mRNA表達水平的檢測
            3.2.3.1 標準質(zhì)粒的構(gòu)建
            3.2.3.2 定量PCR標準曲線的繪制
+CD25^-T細胞活化不同時間的細胞因子分泌譜'>            3.2.3.3 CD4⁺CD25^-T細胞活化不同時間的細胞因子分泌譜
+CD25^-T細胞的細胞因子及CTLA-4mRNA表達水平的作用'>            3.2.3.4 PTD-hFOXP3對CD4⁺CD25^-T細胞的細胞因子及CTLA-4mRNA表達水平的作用
+CD25^T細胞的CTLA-4蛋白水平的檢測'>        3.2.4 PBMCs分泌的細胞因子及CD4⁺CD25^T細胞的CTLA-4蛋白水平的檢測
            3.2.4.1 標本的收集
            3.2.4.2 ELISA檢測標本
            3.2.4.3 Flow cytomctry檢測CTLA-4蛋白水平的檢測
+CD25^-T細胞的免疫抑制實驗'>        3.2.5 PTD-hFOXP3轉(zhuǎn)導的CD4⁺CD25^-T細胞的免疫抑制實驗
        3.2.6 雙向混合淋巴細胞反應（MLR）
        3.2.7 染色質(zhì)免疫共沉淀（ChIP）
        3.2.8 統(tǒng)計學處理
    3.3 實驗結(jié)果
        3.3.1 成功制備PTD-hFOXP3、hFOXP3和PTD-eGFP融合蛋白
        3.3.2 確定T細胞活化條件
+CD25^-T細胞的增殖'>        3.3.3 PTD-hFOXP3抑制活化CD4⁺CD25^-T細胞的增殖
+CD25^-T細胞分泌的細胞因子及CTLA-4表達的影響'>        3.3.4 PTD-hFOXP3對CD4⁺CD25^-T細胞分泌的細胞因子及CTLA-4表達的影響
            3.3.4.1 標準質(zhì)粒的構(gòu)建
+CD25^-T細胞活化不同時間細胞因子及CTLA-4表達情況'>            3.3.4.2 CD4⁺CD25^-T細胞活化不同時間細胞因子及CTLA-4表達情況
+CD25^-T細胞分泌的細胞因子及CTLA-4在mRNA水平上的影響'>            3.3.4.3 融合蛋白對CD4⁺CD25^-T細胞分泌的細胞因子及CTLA-4在mRNA水平上的影響
            3.3.4.4 ELISA檢測融合蛋白對PBMC分泌的細胞因子在蛋白水平上的影響
            3.3.4.5 Flow cytometry檢測CTLA-4蛋白水平的檢測
+CD25^-T細胞對效應細胞的增殖抑制作用'>        3.3.5 PTD-hFOXP3轉(zhuǎn)導的CD4⁺CD25^-T細胞對效應細胞的增殖抑制作用
        3.3.6 PTD-hFOXP3抑制雙向混合淋巴細胞反應（MLR）
+CD25^-T細胞的IL-2啟動子而下調(diào)其表達'>        3.3.7 PTD-hFOXP3能夠直接結(jié)合CD4⁺CD25^-T細胞的IL-2啟動子而下調(diào)其表達
    3.4 討論
    3.5 小結(jié)
第四章 PTD-mFoxp3對Th17、Th1體外分化的影響
    4.1 材料
        4.1.1 實驗菌株和質(zhì)粒
        4.1.2 主要試劑及儀器
    4.2 方法
        4.2.1 PTD-mFoxp3與mFoxp3融合蛋白的制備
+T細胞'>        4.2.2 磁珠法分離小鼠CD4⁺T細胞
            4.2.2.1 準備工作
            4.2.2.2 洗磁珠
+T細胞'>            4.2.2.3 陰性分選小鼠CD4⁺T細胞
        4.2.3 體外誘導鼠Th17的分化
        4.2.4 定量PCR檢測mouse IL-17A和mouse RORγt在mRNA水平的表達
        4.2.5 流式細胞術(shù)檢測胞內(nèi)mouse IL-17A的表達
        4.2.6 ELISA方法檢測mouse IL-17A的表達
        4.2.7 PTD-mFoxp3對鼠Th1體外分化的影響
        4.2.8 統(tǒng)計學處理
    4.3 實驗結(jié)果
        4.3.1 成功制備PTD-mFoxp3與mFoxp3融合蛋白
        4.3.2 鼠IL-17A和RORγt標準質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.3 鼠Th17體外分化條件的摸索
        4.3.4 定量PCR檢測PTD-mFoxp3對IL-17A和RORγt mRNA表達水平的影響
        4.3.5 流式細胞術(shù)檢測PTD-mFoxp3對IL-17A蛋白表達變化的影響
        4.3.6 ELISA檢測PTD-mFoxp3對IL-17A蛋白表達變化的影響
        4.3.7 鼠IFN-γ和T-bet標準質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.3.8 PTD-mFoxp3對IFN-γ和T-bet mRNA表達水平的影響
        4.3.9 PTD-mFoxp3對IFN-γ和T-bet蛋白水平的影響
    4.4 討論
    4.5 小結(jié)
第五章 PTD-mFoxp3對小鼠遲發(fā)型超敏反應的治療作用及其初步機制研究
    5.1 材料
        5.1.1 主要試劑及儀器
        5.1.2 實驗動物
    5.2 方法
        5.2.1 DTH模型的建立
        5.2.2 PTD-mFoxp3的治療
        5.2.3 觀測指標
            5.2.3.1 小鼠一般情況
            5.2.3.2 小鼠耳廓腫脹程度
            5.2.3.3 小鼠耳片重量差
            5.2.3.4 胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)
            5.2.3.5 小鼠耳廓局部組織變化
            5.2.3.6 小鼠脾臟細胞的增殖活性
            5.2.3.7 耳引流淋巴結(jié)中Tregs和Th1細胞的分布
            5.2.3.8 耳片組織中IFN-γ與T-bet的表達
            5.2.3.9 淋巴結(jié)細胞與脾細胞培養(yǎng)上清IFN-γ的檢測
        5.2.4 統(tǒng)計學處理
    5.3 實驗結(jié)果
        5.3.1 成功復制了DTH模型
        5.3.2 PTD-mFoxp3對DTH小鼠的治療作用
    5.4 討論
    5.5 小結(jié)
第六章 主要結(jié)論及展望
    6.1 主要結(jié)論
    6.2 展望
參考文獻
致謝
攻讀博士學位發(fā)表的學術(shù)論文及其他科研成果

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