糖尿病是一種以高血糖為主要特征的內(nèi)分泌代謝疾病，主要分為1型糖尿病（胰島素依賴型糖尿病）和2型糖尿病兩種類型（非胰島素依賴型糖尿�。�，其中2型糖尿病占發(fā)病總數(shù)的80%～90%，病因主要是組織對胰島素抵抗、胰島素敏感性下降和胰島β細(xì)胞分泌胰島素相對不足。 胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like Polypep Tide1, GLP-1)是食物在腸道內(nèi)的消化吸收過程中，刺激腸道內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生的，由30個氨基酸殘基組成。GLP-1的生理功能主要包括促進(jìn)胰島素的分泌、胰島β細(xì)胞增殖并抑制其凋亡、減緩胃的排空、抑制餐后胰高血糖素的分泌、減少肝糖元的合成、提高胰島素的敏感性以及控制食欲等。臨床研究顯示，GLP-1及其類似物在2型糖尿病的治療過程中具有重要的應(yīng)用價值，其通過增加胰島素的分泌，抑制胰高血糖素的釋放調(diào)節(jié)患者體內(nèi)的血糖濃度。因此，GLP-1作為一種安全、有效的促胰島素分泌物越來越受到關(guān)注。但是，GLP-1被體內(nèi)的二肽基肽酶Ⅳ(Dipeptidyl Peptidase IV, DPP-IV)降解的速度非�？欤浒氚诤芏�，僅1～2min，內(nèi)源性GLP-1分泌量不足的情況下不能積累達(dá)到激動GLP-1受體(GLP-1R)的劑量，故難以應(yīng)用于臨床。因此，研發(fā)一種安全、有效的DPP-IV抑制劑是目前2型糖尿病藥物開發(fā)的一個新熱點(diǎn)。 二肽基肽酶IV (Dipeptidyl Peptidase IV, DPP-IV)又稱CD26，是由科學(xué)家Glenner和Hopsu-Havu在鼠肝臟組織勻漿過程中發(fā)現(xiàn)的一種位于細(xì)胞表面的絲氨酸肽酶(Serine Peptidase)，廣泛表達(dá)于哺乳動物組織中，其催化活性中心位于胞外分子的C末端區(qū)域，DPP-IV能夠特異性地裂解GLP-1的N端二肽殘基：Xaa2Pro(Proline)或Xaa2Ala (Alanine)(Xaa為任意氨基酸)，是體內(nèi)、外主要促使GLP-1降解、失活的關(guān)鍵酶之一。DPP-IV抑制劑的結(jié)構(gòu)與DPP-IV的天然底物相似，含有Xαα-Pro類似結(jié)構(gòu)，可以競爭性地結(jié)合DPP-IV的活化部位，但其親和力卻遠(yuǎn)大于它的天然底物，從而改變DPP-IV的構(gòu)象，降低其催化活性。 2006年10月由默克公司研制成功的磷酸西格列汀(Sitagliptin)是最早獲得FDA審批，并且作為DPP-IV抑制劑上市的治療2型糖尿病的藥物，該藥顯示出較好的降糖效果。但是磷酸西格列汀是化學(xué)合成藥物，價格較昂貴，供貨量少，且存在著較大的副作用，如可能出現(xiàn)超敏反應(yīng)、肝酶升高、上呼吸道感染、鼻咽炎、過敏反應(yīng)、血管性水腫和剝脫性皮膚損害、皮疹、蕁麻疹和胰腺炎。因此，篩選出一種有效，經(jīng)濟(jì)，安全的DPP-IV抑制劑顯得尤為重要。 我們以編碼DPP-IV催化結(jié)構(gòu)域(△DPP-IV)的cDNA質(zhì)粒PMD18為模板，通過PCR反應(yīng)擴(kuò)增DPP-IV催化結(jié)構(gòu)域基因，然后將其克隆到pGex-HisC3載體中，并將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosstta DE3plysS中，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，最后通過親和層析方法獲得了△DPP-IV蛋白。 我們采用發(fā)色底物法建立了DPP-IV酶活性分析體系，檢測純化后的△DPP-IV酶的純度達(dá)90%以上，活力為4.2U/mg，酶反應(yīng)動力學(xué)顯示在前20分鐘內(nèi)該酶顯示了良好的線性關(guān)系。從現(xiàn)有的47種中藥單體化合物中篩選△DPP-IV酶的抑制劑，在每種單體化合物終濃度為1mmol/L的情況下，抑制效果達(dá)到80%以上的單體化合物有兩種，其中異槲皮苷對DPP-IV酶的抑制效果最好，達(dá)到了98.1%，測定其對△DPP-IV的IC50為96.8μmol/L，同時通過雙倒數(shù)作圖法研究發(fā)現(xiàn)異槲皮苷對△DPP-IV的抑制類型為競爭性抑制，抑制常數(shù)Ki為236μmol/L。 從細(xì)胞水平上檢測了異槲皮苷刺激NCI-H716細(xì)胞分泌GLP-1的影響。不同濃度的異槲皮苷溶液和磷酸西格列汀溶液(10μmol/L、50μmol/L和100μmol/L)刺激人腸道內(nèi)分泌細(xì)胞NCI-H716細(xì)胞系不同時間(6h、24h、48h和72h)，結(jié)果顯示，隨著異槲皮苷和磷酸西格列汀濃度的升高和刺激時間的延長GLP-1的分泌量逐漸增多，但異槲皮苷對GLP-1的刺激效果更明顯。 在動物水平上，我們選用了8周齡、體重約20g的昆明小鼠，采用腹腔注射濃度為35mg/kg/day STZ輔以高脂高糖飼料喂養(yǎng)的方式誘導(dǎo)2型糖尿病小鼠模型的建立，連續(xù)注射STZ三天后，小鼠的血糖上升到22.43mmol/L≥11.1mmol/L，即建模成功。小鼠按體重和血糖值隨機(jī)分為6組：正常組、模型組、異槲皮苷低劑量給藥組(20mg/kg)、中劑量給藥組(40mg/kg)、高劑量給藥組(80mg/kg)和陽性藥物磷酸西格列汀組(20mg/kg)，每天觀察飲水量及尿量，每周記錄體重及血糖濃度的變化。連續(xù)給藥8周后，結(jié)果顯示，從外觀上來看，正常組小鼠飲食飲水尿量正常，體重增長快，皮毛有光澤，活動靈活；模型組小鼠多飲多食多尿癥狀明顯，體重減輕，皮毛豎立無光澤，精神萎靡，反應(yīng)遲鈍，異槲皮苷給藥組小鼠一般情況均好于模型組，其中高劑量給藥組(80mg/kg)小鼠整體狀況較好，多飲多食多尿癥狀減輕，磷酸西格列汀給藥組小鼠狀況良好。體重方面，模型組小鼠體重下降，異槲皮苷給藥組小鼠體重與灌胃前體重有明顯上升(p0.001)，磷酸西格列汀給藥組小鼠體重與灌胃前相比明顯上升(p0.001)。血糖方面，與模型組相比，給藥組小鼠血糖濃度明顯下降，其中高劑量組（80mg/kg)小鼠血糖濃度下降明顯，下降到14.8mmol/L(p0.001)；磷酸西格列汀給藥組血糖濃度下降到17.4mmol/L(p0.001)，說明異槲皮苷具有明顯的降血糖效果。在葡萄糖耐受實(shí)驗(yàn)(OGTT)中，結(jié)果顯示，與模型組相比，給藥組血糖濃度明顯降低，即中劑量、高劑量(40mg/kg、80mg/kg)異槲皮苷給藥組和磷酸西格列汀給藥組能明顯拮抗外源葡萄糖引起的血糖升高，低劑量(20mg/kg)異槲皮苷給藥組也能降低外源性葡萄糖引起的血糖升高，但并不明顯，這說明異槲皮苷能夠調(diào)節(jié)糖尿病小鼠體內(nèi)的血糖。異槲皮苷對血清中的DPP-IV活性具有明顯的抑制作用。而在連續(xù)給藥8周后，與模型組相比，給藥組小鼠體內(nèi)的甘油三酯和總膽固醇值變化并不明顯。從體內(nèi)GLP-1的分泌情況來看，在未給予葡萄糖灌胃時，給藥組小鼠空腹血清GLP-1濃度明顯高于模型組，在給予2g/kg體重葡萄糖后的10min時，小鼠體內(nèi)的GLP-1分泌量明顯增多，達(dá)到峰值，其中與模型組相比，高劑量組(80mg/kg)和磷酸西格列汀組的GLP-1分泌量增多(p0.001)。而在給予葡萄糖后的20min時，小鼠體內(nèi)的胰島素分泌量達(dá)到高峰，其中，模型組小鼠體內(nèi)的胰島素分泌偏少，異槲皮苷高劑量組(80mg/kg)和磷酸西格列汀組的小鼠體內(nèi)胰島素分泌量明顯增多(p0.001)。小鼠處死后，取胰腺組織，通過HE染色的方法觀察小鼠胰島細(xì)胞的形態(tài)。結(jié)果顯示，正常組小鼠胰島細(xì)胞數(shù)量多，腺管完整清晰可見，細(xì)胞形態(tài)飽滿，胞質(zhì)豐富淺染，而模型組小鼠胰島明顯萎縮，胰島細(xì)胞不完整，細(xì)胞界限模糊；與模型組相比，異槲皮苷給藥組和磷酸西格列汀組小鼠胰島病理切片腺管部分恢復(fù)飽滿充盈狀態(tài)，細(xì)胞排列規(guī)則，細(xì)胞形態(tài)完整，尤其是高劑量(80mg/kg)給藥組，胰腺細(xì)胞形態(tài)基本恢復(fù)到正常組水平。
【學(xué)位單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R-332;R587.1
【部分圖文】：

圖 1.1 我國各類型糖尿病患者分布比例圖.1.1 The distribution proportion diagram of various types of diabetes inChina糖尿病的并發(fā)癥糖尿病并發(fā)癥是一種常見的慢性并發(fā)癥，是由糖尿病病變而來的，將會重的后果。常見的糖尿病并發(fā)癥包括足病（足部壞疽、截肢）、酮癥酸�。I功能衰竭、尿毒癥）、高血糖高滲狀態(tài)、眼部并發(fā)癥（模糊不清）、乳酸性酸中毒、腦�。X血管病變）、低血糖癥、脂質(zhì)代謝異常、心發(fā)癥、高血壓、神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥、胃輕癱和皮膚病等是糖尿病最常見的，也是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要因素如圖 1.2 所示:

圖 1.2 糖尿病的并發(fā)癥Fig.1.2 Diabetic complication糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)理：糖尿病的慢性并發(fā)癥，即糖、尿?yàn)橹委熖悄虿〉暮诵暮椭攸c(diǎn)，由于傳病治療是把重點(diǎn)放在血糖、血壓上，導(dǎo)致糖尿病并發(fā)癥一直沒有得到制和治療。研究發(fā)現(xiàn)糖尿病這些并發(fā)癥的病理原因是對應(yīng)器官的血管病變，只是腎、眼、足病是以微小血管為主，腦、心臟病則是以中血但其病理基礎(chǔ)都是一樣的，即動脈粥樣硬化。而導(dǎo)致動脈硬化的直接脂的多少，尤其是高密度脂蛋白（HDL）的多少和氧化的低密度脂x-LDL）的情況，而不在于血糖的高低。糖尿病足是指與局部神經(jīng)異�；蚴窍轮h(yuǎn)端外周血管病變相關(guān)的足感染或是深層組織被破環(huán)。在發(fā)達(dá)國家糖尿病患者中，大約 5%-10%患者有不同程度足潰爛癥狀，而 1%的糖尿病患者因此被截肢，目前

游離脂肪酸升高容易導(dǎo)致胰島素抵抗；（2）細(xì)胞因子，肥胖、氧化應(yīng)激等狀況的影響下容易產(chǎn)生的一些細(xì)胞因子，包括瘦素（Leptin）、視黃醇-結(jié)合蛋白-4（RBP-4）、脂聯(lián)素（Adiponectin）白介素-6（IL-6）、纖維蛋白溶酶原活化物抑制物（Plasminogen Activator Inhibitor-1,PAI-1）、抵抗素（Resistin）、α 腫瘤壞死因子（TNF-α）和皮質(zhì)醇等，這些細(xì)胞因子對胰島素信號通路具有阻礙作用，肥胖時脂肪組織產(chǎn)生的細(xì)胞因子為引起全身性胰島素抵抗及 β 細(xì)胞分泌功能障礙的重要原因[31-33]。此外，涉及胰島 β 細(xì)胞分泌胰島素功能及靶組織對胰島素敏感性的多種相關(guān)基因在環(huán)境因素的作用下也容易導(dǎo)致 2 型糖尿病�？傊�，2 型糖尿病的發(fā)病原因是由于個體熱量的攝入過多、消耗的能量不足，導(dǎo)致脂肪增多、體重增加，大量的單核細(xì)胞聚集在脂肪組織內(nèi)，從而刺激脂肪細(xì)胞形成炎癥組織，細(xì)胞因子分泌發(fā)生變化，導(dǎo)致能量代謝發(fā)生障礙[34]。2 型糖尿病的發(fā)病機(jī)制如圖 1.3 所示：
【參考文獻(xiàn)】

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1 李曉麗;劉振;馬衛(wèi)列;張志珍;;人胰高血糖素樣肽-1類似物基因治療對糖尿病大鼠機(jī)體代謝的影響[J];中國生化藥物雜志;2010年04期

2 許嶺翎;;2010年中國2型糖尿病防治指南解讀[J];中國社區(qū)醫(yī)師;2011年07期

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4 榮蓉,陳宇紅,趙詠桔,胡仁明,寧光,羅邦堯,許曼音;2型糖尿病磺脲類失效的強(qiáng)化胰島素治療——胰島素有效劑量及相關(guān)因素分析[J];中國糖尿病雜志;2001年01期

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1 張瑞;苦蕎黃酮及其降血糖活性研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2008年

本文編號：2876788