不對稱細胞分裂是指1個細胞分裂為2個具有不同發(fā)育潛能的細胞，是產(chǎn)生細胞多樣性的基本途徑。Numb蛋白是神經(jīng)發(fā)育中第一個被發(fā)現(xiàn)呈不對稱分布的蛋白，是產(chǎn)生不對稱細胞分裂的重要因素之一。我們從人胎腦cDNA文庫中得到一條與小鼠Numb配體蛋白基因Lnx（Ligand of Numb Protein-X）高度同源的新基因。根據(jù)HUGO命名委員會同意，我們將其命名為人類Numb配體蛋白基因LNX。 該基因全長3737 bp，開放閱讀框從236位到2134位，其編碼蛋白含有4個PDZ結(jié)構(gòu)域和1個與Numb蛋白的PTB結(jié)構(gòu)域作用的LDNPAY基序。Northern雜交、RT-PCR和原位雜交顯示，LNX mRNA在腦中的分布有一定的特異性，而且在膠質(zhì)瘤組織中高表達。小鼠不同發(fā)育階段的腎臟原位雜交顯示，LNX mRNA 主要表達在腎臟髓質(zhì)中，且隨著腎臟的發(fā)育表達量逐漸減少。對基因芯片表達譜數(shù)據(jù)進行聚類分析，發(fā)現(xiàn)LNX基因的相關(guān)基因中包括FE65、Frizzled等信號傳導(dǎo)相關(guān)基因。采用酵母雙雜交系統(tǒng)，我們用LNX蛋白中的PDZ結(jié)構(gòu)域為誘餌，篩選相互作用蛋白。我們發(fā)現(xiàn)Ski相互作用蛋白SKIP和PDZ結(jié)合激酶PBK可以和LNX結(jié)合，酵母結(jié)合試驗、體外pulldown試驗和體內(nèi)免疫共沉淀試驗驗證了它們的相互作用。用熒光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，LNX蛋白可以分別和Numb蛋白、SKIP蛋白和PBK蛋白共定位于細胞核。我們推測，LNX蛋白可能通過其PDZ結(jié)構(gòu)域募集相關(guān)蛋白到特定的細胞內(nèi)區(qū)域組成蛋白復(fù)合體，參與包括Notch途徑在內(nèi)的信號傳導(dǎo)途徑。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：Q987
【部分圖文】：

人LNX蛋白與小鼠Lnx蛋白氨基酸同源比較結(jié)果

3 LNX 的表達譜分析3.1 Northern 表達譜分析用 LNX 基因特異引物從 pBS-LNX建庫質(zhì)粒中擴增得到 1.8 kb 的 PCR 產(chǎn)物 用隨機引物標記法摻入同位素制成 LNX 基因特異性探針 將此探針對Clontech 公司 MTN I 膜進行雜交 雜交結(jié)果用磷屏放射自顯影后用 CyclonStorage Phosphor System 掃描磷屏 圖 6 根據(jù)雜交信號在不同組織中的強弱程度 我們推斷人類 LNX 基因 mRNA 在腦 胎盤腎臟以及胰臟這些組織中的表達量較高 在圖 6 中可以看到存在 3 種轉(zhuǎn)錄本 大小分別為 2.6 kb 2.8 k和 4.0 kb 提示 LNX 基因可能存在 3 種剪接形式 2.6 kb 和 4.0 kb 的轉(zhuǎn)錄本在腦組織中存在 而在心臟 胎盤 腎臟和胰臟中則表達 2.8 kb 的轉(zhuǎn)錄本 LNX在腦組織中的表達特殊性顯示其有可能在腦中起重要作用 值得注意的是 4.0 k圖 5. 人 LNX 基因的染色體結(jié)構(gòu)示意圖

蛋白與 PBK 蛋白相互作用的驗證了驗證酵母雙雜交得到的相互作用蛋白在體外是否可以和 L預(yù)吸附有純化的 GST GST-PBK 融合蛋白的 Santa Cruz的表達有 MBP-PDZ1 的細菌破菌上清共置過夜 將 GST-AgaDS-PAGE電泳分離后電轉(zhuǎn)印 PVDF 膜上 然后用 New Eng 多克隆抗體進行 Western 檢測 在 PVDF 上對應(yīng) MBP-PD現(xiàn)一條分子量約為 50 kDa 的明顯條帶 與 MBP-PDZ1 的預(yù)互吻合 圖 15 而在 GST 的對應(yīng)位置則沒有對應(yīng)條帶 X蛋白可以通過其 PDZ1 結(jié)構(gòu)域與 PBK 蛋白特異性結(jié)合真核表達 Numb 蛋白與(1) MBP, (3) MBP- LNX, (4) MBP-LNX-Nter合實驗結(jié)果 轉(zhuǎn)染 Numb 的 HEK293 細胞全細胞裂解液(2)作為對照
【共引文獻】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 肖迎,唐仕波;Notch-Delta信號系統(tǒng)與神經(jīng)膠質(zhì)細胞的發(fā)育[J];解剖學(xué)研究;2005年02期

2 朱長庚;;星形膠質(zhì)細胞[J];解剖學(xué)報;1990年04期

3 曾憲智,康仲涵,張更;胎兒側(cè)腦室室管膜發(fā)育的免疫組織化學(xué)和電鏡研究[J];解剖學(xué)雜志;2004年04期

4 李雪玲;第Ⅵ類中間絲蛋白—Nestin[J];細胞生物學(xué)雜志;2003年01期

本文編號：2876771