第一部分肺炎衣原體感染巨噬細胞對NF-кB通路激活的影響 目的：以THP-1(人急性白血病單核細胞)源性巨噬細胞為研究對象觀察肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae, C.pn)感染對核因子-кB (NF-кB)通路激活的影響。 方法：用160nmol/L佛波酯孵育THP-1細胞24～48小時,倒置顯微鏡下觀察,見其分化為巨噬細胞后,隨機分為4組：(1)陰性對照組：予以含有50μg/mL低密度脂蛋白(LDL)的培養(yǎng)基孵育48h；(2)陽性對照組：予以含有50μg/mL氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的培養(yǎng)基孵育48h；(3)C.pn感染濃度組：在予以50μg/mL LDL孵育條件下,分別給予1×105、4×105、5×105、1×106IFU C.pn感染48h；(4)C.pn感染時間組：在予以50μg/mL LDL孵育條件下,給予1×106IFU C.pn分別感染24h、48h、72h。用凝膠電泳遷移法(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)檢測C.pn感染對NF-кB通路激活的影響。 結果：陰性對照組的NF-кB通路未見激活,陽性對照組、C.pn感染濃度組和C.pn感染時間組的NF-кB通路有明顯激活。NF-кB的活性隨C.pn感染濃度的增大而增加。相同劑量的C.pn感染,在感染24h時對NF-кB的激活達到最大效應,隨著感染時間的延長,在48h和72h時,NF-кB的活性逐漸下降。 結論：在負荷LDL的情況下,C.pn感染可呈濃度依賴性地激活NF-кB通路,且在感染24h時有最大的激活效應,為我們進一步研究NF-кB在C.pn感染介導動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了理論基礎。 第二部分NF-кB信號通路在肺炎衣原體誘導THP-1源性巨噬細胞泡沫化中的作用 目的：以THP-1源性巨噬細胞為研究對象,利用RNA干擾基因沉默(RNAi)技術沉默NF-кB P65基因表達以抑制NF-кB的活性后,觀察NF-кB活性抑制在C.pn感染誘導巨噬細胞向泡沫細胞轉化中的作用。 方法：首先針對NF-кB基因的P65亞基,將人工設計合成的一組熒光標記的陰性對照序列、一組普通陰性對照(negative control siRNA)序列和3組NF-кB P65siRNA (NF-кB P65siRNA1-3)序列分別轉染入細胞,使用熒光顯微鏡觀察法直接觀察熒光標記的陰性對照序列的轉染效率,使用Real Time-PCR (RT-PCR)和western blot檢測NF-кB P65mRNA和蛋白的表達,篩選出抑制效率高的序列。隨之,用negative control siRNA和篩選出的高效NF-кB P65siRNA序列分別轉染巨噬細胞24h,在予以50μg/mL LDL孵育條件下給予C.pn感染32h,用油紅O染色法觀察巨噬細胞胞漿內脂滴的變化并計數(shù)各組的泡沫細胞數(shù)量。 結果：在熒光顯微鏡下可見轉染入細胞內siRNA呈綠色熒光,熒光細胞的百分率即代表轉染效率,轉染效率為83.33%±2.52。與普通陰性對照組相比,三組NF-кB P65siRNA轉染巨噬細胞后,NF-кB P65mRNA和蛋白表達都有下調,其中NF-кB P65siRNAl和NF-кB P65siRNA3對靶基因的抑制效果佳。在轉染NF-кB P65siRNA后,感染C.pn的巨噬細胞胞漿內脂滴的數(shù)目及體積明顯減少、所形成的的泡沫細胞數(shù)目亦明顯減少。 結論：干擾序列的轉染效率高,NF-кB P65siRNA1和siRNA3轉染后能明顯抑制巨噬細胞內NF-кB P65的表達.NF-кB基因沉默可使C.pn感染誘導的巨噬細胞源性泡沫細胞的形成減少。 第三部分NF-кB信號通路在肺炎衣原體誘導巨噬細胞泡沫化中對膽固醇代謝關鍵基因的調控作用 目的：觀察NF-кB信號通路在C.pn誘導THP-1源性巨噬細胞泡沫化中對膽固醇代謝關鍵基因�；o酶A：膽固醇�；D移酶1(ACAT1)、 ATP結合盒轉運子A1/G1(ABCA1/G1)、 Al型清道夫受體(SR-A1)的調控作用。 方法：用160nmol/L佛波酯孵育THP-1細胞24～48小時,倒置顯微鏡下觀察,見其分化為巨噬細胞后,隨機分為3組：(1) negative control siRNA組：negative control siRNA轉染細胞24h后,在予以50μg/mL LDL孵育條件下,用1×106IFU C.pn感染32h；(2)P65siRNA1組：NF-кB P65siRNAl轉染細胞24h后,在予以50μg/mL LDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h;(3)P65siRNA3組：NF-кB P65siRNA3轉染細胞24h后,在予以50μg/mL LDL孵育條件下,用1×106IFU C.pn感染32h。運用分別運用RT-PCR和Western blot檢測ACATl ABCA1/G1、 SR-A1mRNA和蛋白的表達。 結果：與negative control siRNA組相比,NF-кB P65基因沉默后,再予以C.pn感染可致ACATl、 ABCA1/G1mRNA和蛋白表達明顯下調,SR-A1mRNA和蛋白表達大體趨勢上無明顯改變。提示C.pn感染誘導的巨噬細胞源性泡沫細胞形成,與NF-кB信號通路對巨噬細胞內膽固醇代謝關鍵基因ACATl、 ABCA1/G l、 SR-Al的調控有關。 結論：NF-кB通路在肺炎衣原體誘導THP-1源性巨噬細胞泡沫化的過程中,可通過調控膽固醇代謝關鍵基因的表達而影響膽固醇代謝的穩(wěn)態(tài),這可能是肺炎衣原體介導巨噬細胞向泡沫細胞轉化的機制之一。 第四部分NF-кB和PPAR a/y信號通路在肺炎衣原體感染誘導巨噬細胞泡沫化中的交互作用 目的：觀察NF-кB和PPAR α/γ信號通路在C.pn誘導THP-1源性巨噬細胞泡沫化中的交互作用。 方法：用160nmol/L佛波酯孵育THP-1細胞24～48小時,倒置顯微鏡下觀察,見其分化為巨噬細胞后,分別進行下述兩部分實驗,皆隨機分為三組。觀察NF-кB活性抑制對PPARα/y的影響(1) negative control siRNA組：negative siRNA轉染細胞24h后,在予以50μg/mL LDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h;(2) P65siRNAl組：NF-кB P65siRNAl轉染細胞24h后,在予以50μg/mL LDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h；(3)P65siRNA3組：NF－kB P65siRNA3轉染細胞24h后,在予以50μg/mLLDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h。運用RT-PCR和Western blot檢測PPARα、 PPAR y mRNA和蛋白的表達,觀察PPARα/y的激活改變對NF-κB的影響(1)陰性對照組：在予以50μg/mL LDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h；(2)非諾貝特組：予以20μM/L PPAR a的激動劑非諾貝特預孵育2h后,在給予50μg/mL LDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h；(3)羅格列酮組：予以20μM/LPPARγ的激動劑羅格列酮預孵育2h后,在給予50μg/mL LDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h。運用凝膠電泳遷移法檢測各組NF-кB的活性。 結果：與negative control siRNA組相比,P65siRNAl組和P65siRNA3組PPAR a, PPAR y mRNA和蛋白表達顯著增加,提示C.pn感染可通過NF-кB通路調節(jié)PPARα/y基因的表達；與單純的C.pn感染組相比,非諾貝特和羅格列酮預處理皆明顯抑制了NF-кB的激活,提示C.pn感染可通過PPARα/y通路影響NF-кB的活性。 結論：NF-кB和PPAR a/y信號通路在C.pn感染誘導巨噬細胞泡沫化的過程中可交互作用,它們相互影響共同參與調控膽固醇代謝關鍵基因的表達,從而影響膽固醇代謝的穩(wěn)態(tài)和泡沫細胞的形成。這可能為我們進一步探討C.pn感染促進動脈粥樣硬化的發(fā)病機制及其治療靶點提供新的理論依據(jù)。
【學位單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R363
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文縮略詞表及中文對照
前言
第一部分 肺炎衣原體感染巨噬細胞對NF-κB通路激活的影響
    材料和方法
    結果
    討論
第二部分 NF-κB信號通路在肺炎衣原體誘導THP-1源性巨噬細胞泡沫化中的作用
    材料和方法
    結果
    討論
第三部分 NF-κB信號通路在肺炎衣原體誘導巨噬細胞泡沫化中對膽固醇代謝關鍵基因的調控作用
    材料和方法
    結果
    討論
第四部分 NF-κB和PPAR α/γ信號通路在肺炎衣原體感染誘導巨噬細胞泡沫化中的交互作用
    材料和方法
    結果
    討論
參考文獻
結論
綜述
    參考文獻
附錄 攻讀學位期間發(fā)表論文目錄
致謝

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本文編號：2872036