第一部分肺炎衣原體感染巨噬細(xì)胞對(duì)NF-кB通路激活的影響 目的：以THP-1(人急性白血病單核細(xì)胞)源性巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象觀察肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae, C.pn)感染對(duì)核因子-кB (NF-кB)通路激活的影響。 方法：用160nmol/L佛波酯孵育THP-1細(xì)胞24～48小時(shí),倒置顯微鏡下觀察,見其分化為巨噬細(xì)胞后,隨機(jī)分為4組：(1)陰性對(duì)照組：予以含有50μg/mL低密度脂蛋白(LDL)的培養(yǎng)基孵育48h；(2)陽性對(duì)照組：予以含有50μg/mL氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)的培養(yǎng)基孵育48h；(3)C.pn感染濃度組：在予以50μg/mL LDL孵育條件下,分別給予1×105、4×105、5×105、1×106IFU C.pn感染48h；(4)C.pn感染時(shí)間組：在予以50μg/mL LDL孵育條件下,給予1×106IFU C.pn分別感染24h、48h、72h。用凝膠電泳遷移法(electrophoretic mobility shift assay, EMSA)檢測(cè)C.pn感染對(duì)NF-кB通路激活的影響。 結(jié)果：陰性對(duì)照組的NF-кB通路未見激活,陽性對(duì)照組、C.pn感染濃度組和C.pn感染時(shí)間組的NF-кB通路有明顯激活。NF-кB的活性隨C.pn感染濃度的增大而增加。相同劑量的C.pn感染,在感染24h時(shí)對(duì)NF-кB的激活達(dá)到最大效應(yīng),隨著感染時(shí)間的延長,在48h和72h時(shí),NF-кB的活性逐漸下降。 結(jié)論：在負(fù)荷LDL的情況下,C.pn感染可呈濃度依賴性地激活NF-кB通路,且在感染24h時(shí)有最大的激活效應(yīng),為我們進(jìn)一步研究NF-кB在C.pn感染介導(dǎo)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了理論基礎(chǔ)。 第二部分NF-кB信號(hào)通路在肺炎衣原體誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞泡沫化中的作用 目的：以THP-1源性巨噬細(xì)胞為研究對(duì)象,利用RNA干擾基因沉默(RNAi)技術(shù)沉默NF-кB P65基因表達(dá)以抑制NF-кB的活性后,觀察NF-кB活性抑制在C.pn感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用。 方法：首先針對(duì)NF-кB基因的P65亞基,將人工設(shè)計(jì)合成的一組熒光標(biāo)記的陰性對(duì)照序列、一組普通陰性對(duì)照(negative control siRNA)序列和3組NF-кB P65siRNA (NF-кB P65siRNA1-3)序列分別轉(zhuǎn)染入細(xì)胞,使用熒光顯微鏡觀察法直接觀察熒光標(biāo)記的陰性對(duì)照序列的轉(zhuǎn)染效率,使用Real Time-PCR (RT-PCR)和western blot檢測(cè)NF-кB P65mRNA和蛋白的表達(dá),篩選出抑制效率高的序列。隨之,用negative control siRNA和篩選出的高效NF-кB P65siRNA序列分別轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞24h,在予以50μg/mL LDL孵育條件下給予C.pn感染32h,用油紅O染色法觀察巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)脂滴的變化并計(jì)數(shù)各組的泡沫細(xì)胞數(shù)量。 結(jié)果：在熒光顯微鏡下可見轉(zhuǎn)染入細(xì)胞內(nèi)siRNA呈綠色熒光,熒光細(xì)胞的百分率即代表轉(zhuǎn)染效率,轉(zhuǎn)染效率為83.33%±2.52。與普通陰性對(duì)照組相比,三組NF-кB P65siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞后,NF-кB P65mRNA和蛋白表達(dá)都有下調(diào),其中NF-кB P65siRNAl和NF-кB P65siRNA3對(duì)靶基因的抑制效果佳。在轉(zhuǎn)染NF-кB P65siRNA后,感染C.pn的巨噬細(xì)胞胞漿內(nèi)脂滴的數(shù)目及體積明顯減少、所形成的的泡沫細(xì)胞數(shù)目亦明顯減少。 結(jié)論：干擾序列的轉(zhuǎn)染效率高,NF-кB P65siRNA1和siRNA3轉(zhuǎn)染后能明顯抑制巨噬細(xì)胞內(nèi)NF-кB P65的表達(dá).NF-кB基因沉默可使C.pn感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成減少。 第三部分NF-кB信號(hào)通路在肺炎衣原體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化中對(duì)膽固醇代謝關(guān)鍵基因的調(diào)控作用 目的：觀察NF-кB信號(hào)通路在C.pn誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞泡沫化中對(duì)膽固醇代謝關(guān)鍵基因酰基輔酶A：膽固醇�；D(zhuǎn)移酶1(ACAT1)、 ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1/G1(ABCA1/G1)、 Al型清道夫受體(SR-A1)的調(diào)控作用。 方法：用160nmol/L佛波酯孵育THP-1細(xì)胞24～48小時(shí),倒置顯微鏡下觀察,見其分化為巨噬細(xì)胞后,隨機(jī)分為3組：(1) negative control siRNA組：negative control siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后,在予以50μg/mL LDL孵育條件下,用1×106IFU C.pn感染32h；(2)P65siRNA1組：NF-кB P65siRNAl轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后,在予以50μg/mL LDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h;(3)P65siRNA3組：NF-кB P65siRNA3轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后,在予以50μg/mL LDL孵育條件下,用1×106IFU C.pn感染32h。運(yùn)用分別運(yùn)用RT-PCR和Western blot檢測(cè)ACATl ABCA1/G1、 SR-A1mRNA和蛋白的表達(dá)。 結(jié)果：與negative control siRNA組相比,NF-кB P65基因沉默后,再予以C.pn感染可致ACATl、 ABCA1/G1mRNA和蛋白表達(dá)明顯下調(diào),SR-A1mRNA和蛋白表達(dá)大體趨勢(shì)上無明顯改變。提示C.pn感染誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成,與NF-кB信號(hào)通路對(duì)巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝關(guān)鍵基因ACATl、 ABCA1/G l、 SR-Al的調(diào)控有關(guān)。 結(jié)論：NF-кB通路在肺炎衣原體誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞泡沫化的過程中,可通過調(diào)控膽固醇代謝關(guān)鍵基因的表達(dá)而影響膽固醇代謝的穩(wěn)態(tài),這可能是肺炎衣原體介導(dǎo)巨噬細(xì)胞向泡沫細(xì)胞轉(zhuǎn)化的機(jī)制之一。 第四部分NF-кB和PPAR a/y信號(hào)通路在肺炎衣原體感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化中的交互作用 目的：觀察NF-кB和PPAR α/γ信號(hào)通路在C.pn誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞泡沫化中的交互作用。 方法：用160nmol/L佛波酯孵育THP-1細(xì)胞24～48小時(shí),倒置顯微鏡下觀察,見其分化為巨噬細(xì)胞后,分別進(jìn)行下述兩部分實(shí)驗(yàn),皆隨機(jī)分為三組。觀察NF-кB活性抑制對(duì)PPARα/y的影響(1) negative control siRNA組：negative siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后,在予以50μg/mL LDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h;(2) P65siRNAl組：NF-кB P65siRNAl轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后,在予以50μg/mL LDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h；(3)P65siRNA3組：NF－kB P65siRNA3轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后,在予以50μg/mLLDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h。運(yùn)用RT-PCR和Western blot檢測(cè)PPARα、 PPAR y mRNA和蛋白的表達(dá),觀察PPARα/y的激活改變對(duì)NF-κB的影響(1)陰性對(duì)照組：在予以50μg/mL LDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h；(2)非諾貝特組：予以20μM/L PPAR a的激動(dòng)劑非諾貝特預(yù)孵育2h后,在給予50μg/mL LDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h；(3)羅格列酮組：予以20μM/LPPARγ的激動(dòng)劑羅格列酮預(yù)孵育2h后,在給予50μg/mL LDL孵育條件下,用1×106IFUC.pn感染32h。運(yùn)用凝膠電泳遷移法檢測(cè)各組NF-кB的活性。 結(jié)果：與negative control siRNA組相比,P65siRNAl組和P65siRNA3組PPAR a, PPAR y mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加,提示C.pn感染可通過NF-кB通路調(diào)節(jié)PPARα/y基因的表達(dá)；與單純的C.pn感染組相比,非諾貝特和羅格列酮預(yù)處理皆明顯抑制了NF-кB的激活,提示C.pn感染可通過PPARα/y通路影響NF-кB的活性。 結(jié)論：NF-кB和PPAR a/y信號(hào)通路在C.pn感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化的過程中可交互作用,它們相互影響共同參與調(diào)控膽固醇代謝關(guān)鍵基因的表達(dá),從而影響膽固醇代謝的穩(wěn)態(tài)和泡沫細(xì)胞的形成。這可能為我們進(jìn)一步探討C.pn感染促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制及其治療靶點(diǎn)提供新的理論依據(jù)。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R363
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
英文縮略詞表及中文對(duì)照
前言
第一部分 肺炎衣原體感染巨噬細(xì)胞對(duì)NF-κB通路激活的影響
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
第二部分 NF-κB信號(hào)通路在肺炎衣原體誘導(dǎo)THP-1源性巨噬細(xì)胞泡沫化中的作用
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
第三部分 NF-κB信號(hào)通路在肺炎衣原體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化中對(duì)膽固醇代謝關(guān)鍵基因的調(diào)控作用
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
第四部分 NF-κB和PPAR α/γ信號(hào)通路在肺炎衣原體感染誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞泡沫化中的交互作用
    材料和方法
    結(jié)果
    討論
參考文獻(xiàn)
結(jié)論
綜述
    參考文獻(xiàn)
附錄 攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文目錄
致謝

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本文編號(hào)：2872036