發(fā)布時間：2020-10-31 19:34

　　 目的 利用小鼠胚胎著床初期1～3天子宮組織塊培養(yǎng)分離內(nèi)細胞團，探討獲得胚胎干細胞的可能性及白蒺藜醇甙(TFAG)對小鼠胚胎干細胞向神經(jīng)細胞分化的影響。 方法 分離小鼠胚胎著床初期1～3天(孕4.5～6.5天)小鼠子宮，剪碎后進行組織塊培養(yǎng)，2天內(nèi)分離內(nèi)細胞團，以后按常規(guī)的胚胎干細胞培養(yǎng)及傳代方法進行傳代。分化誘導實驗是將小鼠胚胎干細胞在無白血病生長抑制因子(LIF)及無MEF飼養(yǎng)層條件下形成類胚體(EB)，將EB打散成單細胞，分組添加維甲酸(RA)及TFAG，種植于粘附性的組織培養(yǎng)皿中，誘導分化4天，進行細胞形態(tài)觀察及苔盼藍活細胞計數(shù)；再在無RA及TFAG的條件下培養(yǎng)2天后用抗小鼠NF200及GFAP抗體進行免疫組化鑒定。 結(jié)果 用這種方法已建立一株小鼠胚胎干細胞系，傳至第10代，AKP染色強陽性，RT-PCR證實Oct-4表達強陽性。分化誘導實驗中，各組均加相同濃度RA，其濃度為5×10~(-7)mol/L，不加TFAG的對照組活細胞計數(shù)為5.5×10~4/ml，轉(zhuǎn)化的細胞40％為神經(jīng)元細胞，10％為神經(jīng)膠質(zhì)細胞；與對照組比較，實驗組TFAG在濃度分別為5×10~(-3)g/L、5×10~(-4)g/L、5×10~(-5)g/L、5×10~(-6)g/L時，活細胞計數(shù)分別為對照組的11.9、6.2、2.8、1.2倍，轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元細胞所占比例分別為對照組的1.9、1.6、1.4、1.1倍，轉(zhuǎn)化的神經(jīng)膠質(zhì)細胞所占比例無變化。 結(jié)論 1．小鼠胚胎著床初期1～3天子宮組織塊培養(yǎng)可以分離出未分化的內(nèi)細胞團，獲得胚胎干細胞；與傳統(tǒng)方法相比，這種新方法極大簡化了實驗步驟，降低了實驗技術難度。2．TFAG可明顯加快轉(zhuǎn)化的神經(jīng)細胞生長，高濃度時可誘導EB細胞向神經(jīng)元細胞轉(zhuǎn)化。
【學位單位】：中南大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2003
【中圖分類】：R329
【部分圖文】：

養(yǎng)4天后子宮內(nèi)膜組織團塊。4ES細胞體外誘導分化4.1ES細胞在無LIF條件下培養(yǎng)4天后明顯可見EB形成，懸浮生長，如圖1一12(P，。)所示。4.2EB細胞團經(jīng)RA誘導后，向神經(jīng)細胞分化的形態(tài)特征:EB細胞離散成單層，單純經(jīng)RA誘導后第48小時就可見部分神經(jīng)樣細胞，并有神經(jīng)樣突起;第96小時可見有神經(jīng)突起的延長，并有大量死亡細胞碎片;再進行消化后培養(yǎng)兩天，細胞在數(shù)量及形態(tài)上有較大改變;經(jīng)免疫組化證實可見較多NFZOO陽性細胞，如圖1一13(P19)所示。

圖1一9小鼠I以團AKP染色。小鼠子宮剪碎后加ES培養(yǎng)基培養(yǎng)，第四天形成明顯的工CM細胞團，AKP染色呈強陽性(100x)圖1一10第10代ES細胞團AKp染色。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)可形成明顯的ES細胞團，AKP染色呈強陽性(400x)圖卜12Es細胞在無LIF條件下4天后明顯可見EB形成，圖1一13EB細胞單純經(jīng)RA誘導后用NFZoo免疫組呈懸浮生長，細胞團不規(guī)則橢圓形，邊緣似有分化(200x)化證實可見神經(jīng)元細胞，NFZoo陽性〔100x)

博士學位論文第一部分圖1一9小鼠I以團AKP染色。小鼠子宮剪碎后加ES培養(yǎng)基培養(yǎng)，第四天形成明顯的工CM細胞團，AKP染色呈強陽性(100x)圖1一10第10代ES細胞團AKp染色。無飼養(yǎng)層培養(yǎng)可形成明顯的ES細胞團，AKP染色呈強陽性(400x)圖卜12Es細胞在無LIF條件下4天后明顯可見EB形成，圖1一13EB細胞單純經(jīng)RA誘導后用NFZoo免疫組呈懸浮生長，細胞團不規(guī)則橢圓形，邊緣似有分化(200x)化證實可見神經(jīng)元細胞，NFZoo陽性〔100x)圖卜IEB細胞經(jīng)RA和5、10一3昨的TFAG誘導后神經(jīng)細胞生長旺盛，免疫組化證實可見大量NF200陽性細胞(400X)圖2-2EB細胞經(jīng)RA和sug/L的TFAG誘導后免疫組化證實可見典型神經(jīng)元細胞
【引證文獻】

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2 沈雙宏;胡隨瑜;唐鳳英;王勇華;;復方刺蒺藜苷對慢性應激抑郁模型大鼠行為學及海馬CNTF表達的影響[J];中國臨床心理學雜志;2006年03期

3 沈雙宏;沈曉東;胡隨遇;杜建;譚春江;;刺蒺藜苷對抑郁模型大鼠海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生的影響[J];中醫(yī)藥學報;2008年03期

相關博士學位論文 前2條

1 沈雙宏;復方刺蒺藜苷對抑郁模型大鼠行為學、海馬神經(jīng)元CNTF表達及其神經(jīng)發(fā)生的影響[D];中南大學;2006年

2 黃川原;白松片對慢性抑郁模型大鼠PKA、SYP表達的影響[D];中南大學;2006年

本文編號：2864410