增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）是一種在DNA復制、DNA修復、細胞周期調(diào)控等機制中發(fā)揮重要功能的核蛋白，我們對人增殖細胞核抗原（human proliferating cell nuclear antigen，hPCNA）基因.538~+60區(qū)域啟動子的調(diào)控做了比較全面的分析，著重研究了5′啟動子中的血清刺激應答元件以及PCNA在細胞周期DNA損傷檢查點（check point）機制中的轉錄調(diào)控。 PCNA的合成在細胞周期中受嚴格調(diào)控。我們通過檢測hPCNA啟動子報告基因在同步化L-02細胞中的瞬時表達，分析了.538~+60范圍內(nèi)17個潛在元件對血清刺激啟動子上調(diào)的貢獻。發(fā)現(xiàn)位于.84~.75位的5′-TTCCCCGCAA-3′ 類E2F序列是血清誘導啟動子上調(diào)的應答元件。在凝膠阻滯實驗中，L-02核抽提物與含有.84~.75位類E2F序列的寡核苷酸形成兩個結合條帶，其中含量較少、分子量稍小的條帶代表S期特異復合物，可被E2F-1抗體干擾。這是對hPCNA 5′啟動子區(qū)域中血清應答元件的首次描述。 4-Nitroquinoline N-oxide（4-NQO）是一種很強的致突變劑和致癌物。DNA損傷檢查點是細胞周期中的重要控制機制，它能夠隨時應答DNA損傷信號，休止細胞周期，誘導DNA修復。為了研究PCNA這一DNA復制、修復機器中的必需因子在DNA損傷檢查點機制中的表達調(diào)控，我們研究了PCNA對4-NQO所致DNA損傷的應答。首先用瞬時轉染的方法檢測了Hep G2細胞中4-NQO 1 WP=4 對hPCNA啟動子轉錄調(diào)控的影響，發(fā)現(xiàn)4-NQO在0~2 μmol/L濃度范圍內(nèi)，以劑量依賴的方式通過–236~–217位p53結合元件激活hPCNA啟動子轉錄，該轉錄激活作用需要p53蛋白參與。Western blot數(shù)據(jù)顯示，4-NQO處理Hep G2細胞后15位絲氨酸磷酸化的p53大大增長，相比之下p53含量較處理前僅有少許增長。用絲氨酸/蘇氨酸蛋白酶抑制劑staurosporine與4-NQO共同處理細胞后，磷酸化p53的大幅提高和hPCNA啟動子對4-NQO的敏感性同時消失，提示15位絲氨酸磷酸化的p53是使PCNA應答4-NQO的調(diào)控蛋白。[3H]-TdR摻入實驗和單細胞凝膠電泳分析顯示，4-NQO作用后，細胞內(nèi)DNA復制被抑制，而DNA修復被激活，上調(diào)的PCNA參與DNA修復。這一工作對4-NQO處理所致的細胞內(nèi)應答，尤其是PCNA的轉錄調(diào)控，以及該調(diào)控機制的生理意義作了比較深入的研究。 hPCNA作為一個看家基因，需要在不同細胞的各種生理狀態(tài)下廣泛地表達。我們利用報告基因系統(tǒng)檢測了hPCNA啟動子.538~+60區(qū)域內(nèi)的17個潛在元件在HeLa、Hep G2、MCF7、L-02細胞中對啟動子活力的貢獻，發(fā)現(xiàn).45位ATF位點是hPCNA啟動子通用的轉錄元件；位于.210~.75區(qū)域的6個相鄰元件：.199類RA位點、.186 SP1位點、.139 CTF位點、.122 SP1位點、.94 CTF位點和.75 E2F位點突變hPCNA啟動子活力也有較大影響，且存在一定的細胞特異性；.498類Ets-1位點、.216 p53位點、.64類AP2位點和+38類E2F位點對啟動子活力的貢獻在不同細胞株中差異較大，是細胞類型特異的轉錄元件。同時，我們還構建了.94 CTF位點和.75 E2F位點雙突變的報告質(zhì)粒，對相鄰轉錄元件之間的協(xié)同作用進行了初步的分析。
【學位單位】：中國科學院研究生院（上海生命科學研究院）
【學位級別】：博士
【學位年份】：2003
【中圖分類】：R346
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
縮略詞表
引言
第一部分 人增殖細胞核抗原基因5′啟動子內(nèi)的E2F元件應答血清刺激依賴的轉錄上調(diào)
    前言
    材料和方法
    結果
    討論
第二部分 p53應答4-Nitroquinoline N-oxide處理激活人增殖細胞核抗原的DNA修復功能
    前言
    材料和方法
    結果
    討論
第三部分 人增殖細胞核抗原在HeLa、HepG2、L-02、MCF7細胞中的順式轉錄元件
    前言
    材料和方法
    結果
    討論
參考文獻
結論
致謝
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本文編號：2862598