月經(jīng)是包括人類的高等靈長類以及少數(shù)其它胎盤動物所特有的子宮內(nèi)膜周期性脫落的生理現(xiàn)象。解析子宮內(nèi)膜周期性崩解出血與修復(fù)機制是理解異常出血機制和尋找治療異常出血策略的關(guān)鍵所在,對女性生殖健康具有重大的意義。 關(guān)于月經(jīng)的早期研究可以追溯到1940s,Markee利用恒河猴子宮內(nèi)膜外植體模型,直觀地觀察到子宮內(nèi)膜在月經(jīng)周期中的變化。Markee觀察到在月經(jīng)發(fā)生前,子宮內(nèi)膜中的螺旋動脈發(fā)生約24h的痙攣收縮。由此推測,組織缺血缺氧是造成子宮內(nèi)膜崩解的始動原因。由于長期缺乏理想的模式動物模型,月經(jīng)機制的研究進展較為緩慢。八十年代,最常用的哺乳類模式動物——小鼠首次被帶入月經(jīng)機制的研究領(lǐng)域。本世紀初,小鼠月經(jīng)樣模型已經(jīng)得到優(yōu)化。在2007年,本實驗室成功建立了小鼠藥理性孕酮撤退月經(jīng)樣模型,并且對月經(jīng)的發(fā)生機制進行了前期的探索性研究。在對小鼠月經(jīng)樣模型孕酮撤退后的不同時間點進行Pathway Finder芯片檢測后,在芯片數(shù)據(jù)解析中發(fā)現(xiàn),低氧反應(yīng)相關(guān)基因和血管內(nèi)皮生長因子(Vegf) mRNA的表達量在子宮內(nèi)膜的崩解過程中逐漸增高。對12h和16h兩個處理組進行全基因組表達譜芯片檢測,GO分析(Gene Ontology)中發(fā)現(xiàn),在這兩個處理組中,與低氧反應(yīng)有關(guān)的基因數(shù)目較多,其中低氧誘導(dǎo)因子Hif1α和Vegf mRNA表達升高顯著。 本研究以小鼠生理性孕酮撤退月經(jīng)樣模型和小鼠／人蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞模擬激素撤退為基礎(chǔ),探討了孕酮撤退、低氧、HIF1A(低氧誘導(dǎo)因子)與VEGF(血管內(nèi)皮生長因子)在月經(jīng)發(fā)生過程中的調(diào)控關(guān)系。主要結(jié)果如下： 1.在小鼠月經(jīng)樣模型與體外培養(yǎng)模擬月經(jīng)發(fā)生的小鼠／人蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞中,孕酮撤退造成Hif1αmRNA的上調(diào),并且HIF1A在細胞核內(nèi)的表達量升高,即HIF1A的功能被激活。孕酮撤退后,VegfmRNA表達與蛋白質(zhì)表達量均升高。 2.在小鼠月經(jīng)樣模型的崩解期(0-24h),HIF1A與VEGF蛋白質(zhì)的定位具有相關(guān)性。進一步檢測發(fā)現(xiàn),HIF1A與Vegf的啟動子區(qū)域直接結(jié)合的相對量在P4撤退后升高,峰值在12h出現(xiàn),與Vegf mRNA表達的峰值時間相同。說明在小鼠月經(jīng)樣模型崩解期,HIF1A直接調(diào)控Vegf mRNA的表達。小鼠月經(jīng)樣模型的崩解期(0-24h),抑制HIF1A后,子宮內(nèi)膜中VEGF蛋白質(zhì)的表達量降低,同時,子宮內(nèi)膜的崩解受到抑制。此結(jié)果證實了HIF1A對子宮內(nèi)膜的崩解具有重要作用,并且P4撤退能夠通過HIF1A上調(diào)Vegf基因的表達。 3.在小鼠月經(jīng)樣模型的修復(fù)期(32-48h),HIF1A與VEGF蛋白質(zhì)的定位相一致。進一步檢測發(fā)現(xiàn),HIF1A與Vegf的啟動子區(qū)域直接結(jié)合的相對量在32h顯著高于48h(P0.05)。說明在小鼠月經(jīng)樣模型修復(fù)期,HIF1A直接調(diào)控Vegf mRNA的表達。小鼠月經(jīng)樣模型的修復(fù)期(0-32h),抑制HIF1A后,子宮內(nèi)膜中VEGF蛋白質(zhì)的表達量降低,同時,子宮內(nèi)膜的修復(fù)受到抑制。此結(jié)果證實了HIF1A對子宮內(nèi)膜的崩解具有重要作用,并且P4撤退能夠通過HIF1A上調(diào)Vegf基因的表達。 4.在體外培養(yǎng)的小鼠/人蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞中,模擬激素撤退后導(dǎo)致Vegf表達量的上調(diào),而在敲降Hifla后Vegf的表達受到抑制。此結(jié)果在細胞水平證實了,在P4撤退后,HIF1A對蛻膜化子宮內(nèi)膜基質(zhì)細胞中具有重要作用,并且P4撤退通過HIF1A上調(diào)Vegf基因的表達。 5.首次在小鼠月經(jīng)樣模型崩解期,檢測到子宮內(nèi)膜中低氧的存在。低氧區(qū)域隨著子宮內(nèi)膜崩解的進程逐漸擴大。在小鼠月經(jīng)樣模型模擬低氧后,未能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜的崩解,證實低氧不是子宮內(nèi)膜崩解的起始因素。 6.在低氧區(qū)域,HIF1A在小鼠月經(jīng)樣模型崩解期大量表達于細胞核內(nèi)。低氧、HIF1A與VEGF蛋白質(zhì)的表達定位存在相關(guān)性。小鼠/人蛻膜化子宮內(nèi)膜間質(zhì)細胞體外培養(yǎng),在模擬低氧和低氧培養(yǎng)條件下均能激活HIF1A并上調(diào)Vegf mRNA與蛋白質(zhì)的表達,而敲降Hiflα后Vegf的表達受到抑制。說明低氧能夠通過激活HIF1A調(diào)控VEGF的表達。 本論文中還涉及了小鼠月經(jīng)樣模型中NF-KB與COX-2的相關(guān)研究。研究發(fā)現(xiàn),COX-2抑制劑能夠顯著抑制子宮內(nèi)膜的崩解,并顯著降低COX-2的酶活性和體內(nèi)前列腺素PGF2a的含量。NF-κB(P50和P65)與COX-2在小鼠月經(jīng)樣模型中定位存在相關(guān)性。進一步利用NF-κB抑制劑干預(yù)小鼠月經(jīng)樣模型,得到COX-2抑制劑相似的表型,COX-2mRNA的表達量也顯著降低,提示P4撤退后,NF-κB調(diào)控COX-2的表達。NF-κB和COX-2抑制劑均能抑制白細胞在子宮內(nèi)膜崩解期的侵潤,提示崩解過程中NF-κB通過調(diào)控COX-2增加PGF2a,而引發(fā)白細胞侵潤以促進子宮內(nèi)膜的崩解。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R711.51;R-332
【部分圖文】：

劇烈震蕩15s。室溫靜置2~3min再1管，此時管內(nèi)溶液由下至上分為3層，即粉色有溶于無色水相中。小心地吸出上層液體（避免吸的1.5ml RNase-Free的EP管中。ml, -20°C預(yù)冷的異丙醇，EP管上下顛倒混勾，沉30min (亦可-20°C保存過夜，取出回復(fù)室溫再進高速離心lOmin，小心棄上清，防止位于EP管底乙醇（100%乙醇與DEPC水配制），輕彈管壁，心5min，小心棄上清。，自然干燥RNA (避免完全干燥，不利于RNC水，輕輕吹打片刻，室溫靜置lOmin,使RNA量0D值，OD260/280大于1.8?2.0即判定RNA電泳確定RNA的完整性（見圖1-2)。

④37°C溫箱孵育30min，在酶標(biāo)儀562mn波長檢測0D值；以標(biāo)準(zhǔn)液濃度的0D值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（見圖1-5)，依此計算測得樣品濃度。2.5 1 y= 1.1107X-0.1137R2 = 0.9983 AI ： Z0> J Zw ZI 0.5 -工 0 ——, , , ,0.00 0.50 1.00 1.50 2.00O.D.圖1-5蛋白質(zhì)濃度直線圖(3)蛋白變性：根據(jù)測得濃度，計算所需的蛋白量（約30?50mg/樣品），加入5Xloading buffer，置于沸水中解育5min，使蛋白充分變性。(4) SDS-PAGE 凝膠電泳及 Western blot①按照上述SDS-PAGE凝膠配制方法制膠，待膠充分凝固后，組裝好放入電泳槽中，并緩慢加入足量電泳緩沖液，避免產(chǎn)生過多泡沫；用微量注?

口在干凈的吸水紙上，輕敲幾次，使液體盡可能被吸凈。加入lOOjiL Substrate Solution,室溫孵育30min (注意此步加入lOOi^L的Stop solution。小孔中的液體顏色由藍色變顏色呈現(xiàn)綠色或者顏色轉(zhuǎn)變不均勾，可輕輕敲打或在桌面小孔中的液體混充分勾。后30min內(nèi)測定0D值。將酶標(biāo)儀設(shè)置為450nm吸收光。設(shè)定為540~570nm。若波長矯正不可用，則分別檢測波長54n波長吸收光下的值，再將數(shù)值代入以下公式：0D最終值=OD450 — OD540 或 570矯正的0D45()可能比真實值高一些，造成不準(zhǔn)確。量的樣品計算平均值，減去空白對照（Blank)。用VEGF實際濃度，計算出標(biāo)準(zhǔn)濃度曲線（見圖1-6)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲品的0D值代入公式，計算出樣品的VEGF的濃度。若樣乘以稀釋倍數(shù)，得到樣品的實際濃度。1,200 1
【參考文獻】

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1 李云峰;NF-κB信號通路在RU486誘導(dǎo)小鼠月經(jīng)模型月經(jīng)發(fā)生早期過程中的作用[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2011年

2 徐祥波;藥理性孕酮撤退建立小鼠月經(jīng)模型及其初步研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2008年

本文編號：2862246