目的： 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種全世界范圍的人類感染病原菌，對(duì)人類健康構(gòu)成嚴(yán)重危害。本研究擬通過(guò)生物信息學(xué)方法和體外尿素酶活性中和試驗(yàn)篩選穩(wěn)定的能夠替代全長(zhǎng)尿素酶B(UreB)亞單位的活性片段，在此基礎(chǔ)上將片段與另外兩個(gè)已確定的Hp保護(hù)抗原成分熱休克蛋白A(HspA)、鞭毛粘附素蛋白A(npak)構(gòu)建融合基因。通過(guò)不同表達(dá)系統(tǒng)得到多亞單位的蛋白和基因疫苗，分別觀察在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)的不同免疫應(yīng)答和保護(hù)作用，為揭示Hp潛在的保護(hù)性機(jī)制以及新型多亞單位Hp疫苗的研制提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 方法： 1．通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)尿素酶B亞單位蛋白親水性、抗原性和結(jié)構(gòu)功能域等進(jìn)行分析，結(jié)合尿素酶B亞單位蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)X射線衍射圖，依據(jù)尿素酶B亞單位蛋白功能、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，選擇能夠替代全長(zhǎng)亞單位的活性片段。 2．采用PCR方法從HpCQ9803基因組中擴(kuò)增目的片段基因(UreB414)并構(gòu)建到原核表達(dá)載體pET-28a(+)，通過(guò)酶切、測(cè)序鑒定陽(yáng)性重組子。將陽(yáng)性重組子轉(zhuǎn)化宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，Tris-trcine PAGE及免疫印跡確定目的蛋白表達(dá)。Antheprot V 5.0軟件分析蛋白性質(zhì)，AKTA純化儀純化融合蛋白。將純化片段免疫家兔制備高免血清，對(duì)免疫后血清通過(guò)體外尿素酶中和試驗(yàn)檢驗(yàn)片段的生物學(xué)活性。 3．http://mathbio.nimr.mrc.ac.uk蛋白linker庫(kù)中選擇合適的蛋白linker，采用重疊延伸的方法，以HspA為融合蛋白前端，將HspA、HpaA及UreB活性片段依次串聯(lián)，酶切及測(cè)序鑒定連接結(jié)果，NcoI、XhoI雙酶切將融合基因構(gòu)建到原核表達(dá)載體中。SDS-PAGE電泳和免疫印跡鑒定融合蛋白表達(dá)，軟件分析融合蛋白理化特性，通過(guò)包涵體洗滌，純化條件摸索，AKTA純化儀純化融合蛋白。 4．將160只小鼠隨機(jī)分為4組：融合蛋白組(HspA-HpaA-UreB414)、三亞單位物理混合組(HspA+HpaA+UreB)、單一尿素酶組(UreB)和PBS對(duì)照組。以LT無(wú)毒突變體為佐劑，分別于O、7、14、28天免疫接種，劑量為150μg／只／次。末次免疫后10天，每組取10只小鼠剖殺取樣，ELISA檢測(cè)口服免疫后血清特異IgG、IgA、IgGl、IgG2a， 第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 糞便、胃腸道沖洗液slgA，EISp0T法檢測(cè)小腸Pp結(jié)19卉^sc、xgG一^se數(shù)目，盯一PeR 檢測(cè)脾臟淋巴細(xì)胞IL一4，正N一Y水平。每組余下30只口服10scFu Hp動(dòng)物適應(yīng)株，30 天后通過(guò)Hp培養(yǎng)、快速尿素酶試驗(yàn)、涂片及特異性PCR檢測(cè)小鼠胃部標(biāo)本并計(jì)算口服 免疫后各組攻毒保護(hù)率。 5，將融合基因構(gòu)建到真核表達(dá)載體pCDNA3.1(+)，酶切及測(cè)序鑒定得到陽(yáng)性重組 子。磷酸鈣法將陽(yáng)性重組子轉(zhuǎn)染COS一7細(xì)胞，RT一PCR方法確定了融合基因在細(xì)胞中的 表達(dá)。40只BALB/c小鼠，隨機(jī)分為2組，大量抽提質(zhì)粒，分別以空質(zhì)粒載體和陽(yáng)性重 組子質(zhì)粒，按照O、21、42天各一次，每次100林g/.q/次脛前肌注射的方案免疫接種小 鼠，在末次免疫后30天依前法檢測(cè)免疫后血液、胃腸道沖洗液標(biāo)本指標(biāo)及攻毒保護(hù)率。 結(jié)果: 1.選擇了從UreB蛋白中5’端251位氨基酸到389位氨基酸的138個(gè)氨基酸為目的 片段UreB414，該片段含有己確定的CHHLDKSIKEDV12膚的尿素酶活性相關(guān)位點(diǎn)。 2.成功構(gòu)建目的片段的表達(dá)載體pET一28a-UreB414，目的片段分子量約為巧.SKD， 包涵體鑒定試驗(yàn)證實(shí)為可溶形式表達(dá)，純化后得到90%純度的目的蛋白，.蛋白免疫家 兔后產(chǎn)生的抗體在體外能夠中和尿素酶活性。 3.成功構(gòu)建了包含HsPA、HpaA、UreB414三個(gè)Hp保護(hù)性亞單位的融合基因，不 同基因組分之間以R場(chǎng)甲PP6氨基酸linker的相應(yīng)堿基連接，該U川沈r為非螺旋剛性蛋 白linker。 4.得到融合蛋白表達(dá)載體phhu，表達(dá)的融合蛋白具有三個(gè)亞單位蛋白各自的免疫 反應(yīng)性，分子量約為43.9KD。UVP掃描證實(shí)融合蛋白表達(dá)約占總蛋白的26%。包涵體 鑒定試驗(yàn)證實(shí)融合蛋白以包涵體形式表達(dá)，確定了采用親和層析、離子交換層析相結(jié)合 的純化方法。純化后得到純度85%的融合蛋白。 5.融合蛋白組血清IgG、IgA，糞便，胃腸道沖洗液slgA水平，腸道PP結(jié)IgA一Asc、 IgG一AsC細(xì)胞數(shù)量與PBs組相比，升高明顯，差異非常顯著(P0 .001)，與三個(gè)亞單位 蛋白物理混合組相比，無(wú)明顯差別(P0.05)，血清IgGI、IgGZa，脾臟淋巴細(xì)胞體外Hp 刺激后IL一4，正N一Y的水平都明顯增高。融合蛋白組、三個(gè)亞單位物理混合組和單一蛋 白組小鼠的攻毒保護(hù)率分別為89.6%、72.3%和65.5%。 6.轉(zhuǎn)染后融合基因能夠在細(xì)胞中的表達(dá)。與空質(zhì)粒免疫對(duì)照組相比，融合基因免 疫組小鼠血清IgG、IgA顯著升高(P0.001)，糞便，胃腸道粘液slgA未見(jiàn)升高，血清IgG 以IgGZa升高為主。動(dòng)物攻毒保護(hù)率為88.75%。 結(jié)論: 第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 1.通過(guò)理論預(yù)測(cè)及尿素酶體外中和試驗(yàn)實(shí)驗(yàn)得到性質(zhì)穩(wěn)定能夠替代全長(zhǎng)尿素酶B 亞單位的活性片段UreB414。 2.重組融合蛋白經(jīng)口服免疫后激發(fā)的為一種Thl、Th:平衡的免疫應(yīng)答模式小鼠免 疫應(yīng)答，攻毒保護(hù)試驗(yàn)取得89.6%的保護(hù)率。融合蛋白組小鼠的攻毒保護(hù)率顯著高于單 一蛋白組(P二0.0283)。 3.Hp多亞單位融合基因DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠，誘導(dǎo)產(chǎn)生一種以Th;為主 ?
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

一、尿素酶B亞單位結(jié)構(gòu)分析結(jié)果蛋白功能結(jié)構(gòu)分析中認(rèn)為尿素酶B亞單位蛋白中從319位氨基酸到335位氨基酸為尿素酶活性位點(diǎn)，如圖1一2所示，尿素酶B蛋白晶體衍射圖和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析確認(rèn)尿素酶B蛋白從250位氨基酸到390位氨基酸之間共有5個(gè)a螺旋，251位氨基酸和389位氨基酸分別為2個(gè)。螺旋的起點(diǎn)和終點(diǎn)，對(duì)片段的穩(wěn)定性有很大的作用，親水性、抗原性分析認(rèn)為該片段區(qū)域抗原性強(qiáng)，大多位于整個(gè)蛋白表面。箭頭所指為尿素酶活性相關(guān)區(qū)域。如圖1一1，1一3圖1一1尿素酶B亞單位蛋白質(zhì)3級(jí)結(jié)構(gòu)晶體衍射圖Figl一1theanalysisofProteinUreBwithX一ray

(2690bP)7:DNAMarkerDL15，000bP圖1一5重組克隆質(zhì)粒酶切鑒定Figl一5Id曲tifieationofreeombinantPlas而dsbyrestrietionendonucleaseanalysis

2:100bPDNAladderm田)kef圖1一4瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)UreB414片段基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Figl一4PCRProduetofUreB414segmenifromHPstrainsresolvedbyZ·0%agarosegeleleetrOPhoresis.三、UreB414PcR產(chǎn)物克隆載體構(gòu)建結(jié)果克隆連接反應(yīng)中controlins叭DNA連接對(duì)照平板布滿細(xì)菌，陰性對(duì)照平板無(wú)菌落出現(xiàn)，連接產(chǎn)物平板有藍(lán)、白斑菌落生長(zhǎng)。白斑菌落質(zhì)粒經(jīng)Nco卜乃of雙酶切鑒定呈現(xiàn)兩條片段，小片段約為400bp，大片段與藍(lán)斑質(zhì)粒經(jīng)BamHI單酶切片段大小一致，約為2690bP左右。見(jiàn)圖l一5。1234567l:loobpDNAladderm盯ker2:PCRProduetofHPstrains(414飾)2，500bP3，4
【引證文獻(xiàn)】

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1 劉開(kāi)云;減毒鼠傷寒沙門菌為載體的幽門螺桿菌治療性疫苗實(shí)驗(yàn)研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2011年

2 邵美麗;豬傳染性胸膜肺炎重組亞單位疫苗的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

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1 王勇;豬傳染性胸膜肺炎重組亞單位菌苗研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2007年

本文編號(hào)：2861986