發(fā)布時間：2020-10-30 04:26

　　 目的： 幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是一種全世界范圍的人類感染病原菌，對人類健康構成嚴重危害。本研究擬通過生物信息學方法和體外尿素酶活性中和試驗篩選穩(wěn)定的能夠替代全長尿素酶B(UreB)亞單位的活性片段，在此基礎上將片段與另外兩個已確定的Hp保護抗原成分熱休克蛋白A(HspA)、鞭毛粘附素蛋白A(npak)構建融合基因。通過不同表達系統(tǒng)得到多亞單位的蛋白和基因疫苗，分別觀察在小鼠體內誘導的不同免疫應答和保護作用，為揭示Hp潛在的保護性機制以及新型多亞單位Hp疫苗的研制提供理論和實驗依據。 方法： 1．通過生物信息學方法對尿素酶B亞單位蛋白親水性、抗原性和結構功能域等進行分析，結合尿素酶B亞單位蛋白的三級結構X射線衍射圖，依據尿素酶B亞單位蛋白功能、結構穩(wěn)定性，選擇能夠替代全長亞單位的活性片段。 2．采用PCR方法從HpCQ9803基因組中擴增目的片段基因(UreB414)并構建到原核表達載體pET-28a(+)，通過酶切、測序鑒定陽性重組子。將陽性重組子轉化宿主菌大腸桿菌BL21(DE3)中，IPTG誘導表達，Tris-trcine PAGE及免疫印跡確定目的蛋白表達。Antheprot V 5.0軟件分析蛋白性質，AKTA純化儀純化融合蛋白。將純化片段免疫家兔制備高免血清，對免疫后血清通過體外尿素酶中和試驗檢驗片段的生物學活性。 3．http://mathbio.nimr.mrc.ac.uk蛋白linker庫中選擇合適的蛋白linker，采用重疊延伸的方法，以HspA為融合蛋白前端，將HspA、HpaA及UreB活性片段依次串聯(lián)，酶切及測序鑒定連接結果，NcoI、XhoI雙酶切將融合基因構建到原核表達載體中。SDS-PAGE電泳和免疫印跡鑒定融合蛋白表達，軟件分析融合蛋白理化特性，通過包涵體洗滌，純化條件摸索，AKTA純化儀純化融合蛋白。 4．將160只小鼠隨機分為4組：融合蛋白組(HspA-HpaA-UreB414)、三亞單位物理混合組(HspA+HpaA+UreB)、單一尿素酶組(UreB)和PBS對照組。以LT無毒突變體為佐劑，分別于O、7、14、28天免疫接種，劑量為150μg／只／次。末次免疫后10天，每組取10只小鼠剖殺取樣，ELISA檢測口服免疫后血清特異IgG、IgA、IgGl、IgG2a， 第三軍醫(yī)大學博士學位論文 糞便、胃腸道沖洗液slgA，EISp0T法檢測小腸Pp結19卉^sc、xgG一^se數目，盯一PeR 檢測脾臟淋巴細胞IL一4，正N一Y水平。每組余下30只口服10scFu Hp動物適應株，30 天后通過Hp培養(yǎng)、快速尿素酶試驗、涂片及特異性PCR檢測小鼠胃部標本并計算口服 免疫后各組攻毒保護率。 5，將融合基因構建到真核表達載體pCDNA3.1(+)，酶切及測序鑒定得到陽性重組 子。磷酸鈣法將陽性重組子轉染COS一7細胞，RT一PCR方法確定了融合基因在細胞中的 表達。40只BALB/c小鼠，隨機分為2組，大量抽提質粒，分別以空質粒載體和陽性重 組子質粒，按照O、21、42天各一次，每次100林g/.q/次脛前肌注射的方案免疫接種小 鼠，在末次免疫后30天依前法檢測免疫后血液、胃腸道沖洗液標本指標及攻毒保護率。 結果: 1.選擇了從UreB蛋白中5’端251位氨基酸到389位氨基酸的138個氨基酸為目的 片段UreB414，該片段含有己確定的CHHLDKSIKEDV12膚的尿素酶活性相關位點。 2.成功構建目的片段的表達載體pET一28a-UreB414，目的片段分子量約為巧.SKD， 包涵體鑒定試驗證實為可溶形式表達，純化后得到90%純度的目的蛋白，.蛋白免疫家 兔后產生的抗體在體外能夠中和尿素酶活性。 3.成功構建了包含HsPA、HpaA、UreB414三個Hp保護性亞單位的融合基因，不 同基因組分之間以R場甲PP6氨基酸linker的相應堿基連接，該U川沈r為非螺旋剛性蛋 白linker。 4.得到融合蛋白表達載體phhu，表達的融合蛋白具有三個亞單位蛋白各自的免疫 反應性，分子量約為43.9KD。UVP掃描證實融合蛋白表達約占總蛋白的26%。包涵體 鑒定試驗證實融合蛋白以包涵體形式表達，確定了采用親和層析、離子交換層析相結合 的純化方法。純化后得到純度85%的融合蛋白。 5.融合蛋白組血清IgG、IgA，糞便，胃腸道沖洗液slgA水平，腸道PP結IgA一Asc、 IgG一AsC細胞數量與PBs組相比，升高明顯，差異非常顯著(P0 .001)，與三個亞單位 蛋白物理混合組相比，無明顯差別(P0.05)，血清IgGI、IgGZa，脾臟淋巴細胞體外Hp 刺激后IL一4，正N一Y的水平都明顯增高。融合蛋白組、三個亞單位物理混合組和單一蛋 白組小鼠的攻毒保護率分別為89.6%、72.3%和65.5%。 6.轉染后融合基因能夠在細胞中的表達。與空質粒免疫對照組相比，融合基因免 疫組小鼠血清IgG、IgA顯著升高(P0.001)，糞便，胃腸道粘液slgA未見升高，血清IgG 以IgGZa升高為主。動物攻毒保護率為88.75%。 結論: 第三軍醫(yī)大學博士學位論文 1.通過理論預測及尿素酶體外中和試驗實驗得到性質穩(wěn)定能夠替代全長尿素酶B 亞單位的活性片段UreB414。 2.重組融合蛋白經口服免疫后激發(fā)的為一種Thl、Th:平衡的免疫應答模式小鼠免 疫應答，攻毒保護試驗取得89.6%的保護率。融合蛋白組小鼠的攻毒保護率顯著高于單 一蛋白組(P二0.0283)。 3.Hp多亞單位融合基因DNA疫苗肌肉注射免疫小鼠，誘導產生一種以Th;為主 ?
【學位單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

一、尿素酶B亞單位結構分析結果蛋白功能結構分析中認為尿素酶B亞單位蛋白中從319位氨基酸到335位氨基酸為尿素酶活性位點，如圖1一2所示，尿素酶B蛋白晶體衍射圖和二級結構分析確認尿素酶B蛋白從250位氨基酸到390位氨基酸之間共有5個a螺旋，251位氨基酸和389位氨基酸分別為2個。螺旋的起點和終點，對片段的穩(wěn)定性有很大的作用，親水性、抗原性分析認為該片段區(qū)域抗原性強，大多位于整個蛋白表面。箭頭所指為尿素酶活性相關區(qū)域。如圖1一1，1一3圖1一1尿素酶B亞單位蛋白質3級結構晶體衍射圖Figl一1theanalysisofProteinUreBwithX一ray

(2690bP)7:DNAMarkerDL15，000bP圖1一5重組克隆質粒酶切鑒定Figl一5Id曲tifieationofreeombinantPlas而dsbyrestrietionendonucleaseanalysis

2:100bPDNAladderm田)kef圖1一4瓊脂糖凝膠電泳檢測UreB414片段基因的PCR擴增產物Figl一4PCRProduetofUreB414segmenifromHPstrainsresolvedbyZ·0%agarosegeleleetrOPhoresis.三、UreB414PcR產物克隆載體構建結果克隆連接反應中controlins叭DNA連接對照平板布滿細菌，陰性對照平板無菌落出現(xiàn)，連接產物平板有藍、白斑菌落生長。白斑菌落質粒經Nco卜乃of雙酶切鑒定呈現(xiàn)兩條片段，小片段約為400bp，大片段與藍斑質粒經BamHI單酶切片段大小一致，約為2690bP左右。見圖l一5。1234567l:loobpDNAladderm盯ker2:PCRProduetofHPstrains(414飾)2，500bP3，4
【引證文獻】

相關博士學位論文 前2條

1 劉開云;減毒鼠傷寒沙門菌為載體的幽門螺桿菌治療性疫苗實驗研究[D];第三軍醫(yī)大學;2011年

2 邵美麗;豬傳染性胸膜肺炎重組亞單位疫苗的研究[D];東北農業(yè)大學;2006年

相關碩士學位論文 前1條

1 王勇;豬傳染性胸膜肺炎重組亞單位菌苗研究[D];東北農業(yè)大學;2007年

本文編號：2861986