一、研究背景 幽門螺桿菌(H．pylori)感染為慢性活動性胃炎和消化性潰瘍的主要病因，與腸型胃癌和胃黏膜相關(guān)淋巴樣組織(MALT)淋巴瘤的發(fā)生密切相關(guān)。抗生素聯(lián)合制酸劑為目前H．pylori感染主要的治療方案，但隨著細(xì)菌耐藥、藥物不良反應(yīng)及藥效經(jīng)濟(jì)學(xué)等問題的突出，研究接種簡便、成本低廉并易于大面積推廣的H．pylori口服疫苗越來越受到重視。 篩選高度保守，具有良好免疫原性和免疫反應(yīng)性的表面抗原對H．pylori疫苗的研制具有重要的意義。尿素酶(Ure)既是定植因子，又是毒力因子，為H．pylori生存所必需。其B亞單位(UreB)抗原性最強(qiáng)，是目前較為肯定的H．pylori疫苗候選抗原。中性粒細(xì)胞激活蛋白(HP-NAP)為新近發(fā)現(xiàn)的H．pylori主要毒力因子。黏附素A(HpaA)為H．pylori鞭毛鞘膜蛋白，也是其主要的黏附因子。研究表明，三者序列高度保守，結(jié)合于菌體表面，具有較強(qiáng)的免疫原性，可作為有效的保護(hù)性抗原用于H．pylori感染的疫苗防治。 目前，國內(nèi)外H．pylori口服疫苗的研究主要集中在蛋白質(zhì)疫苗的研制。但蛋白質(zhì)抗原的制備和純化費時、費力，需同時應(yīng)用佐劑才能誘導(dǎo)有效的免疫反應(yīng)，而佐劑大多對機(jī)體有不同程度的毒性作用。探索新型疫苗系統(tǒng)對H．pylori口服疫苗的研制具有重要的實際意義。 DNA疫苗因可誘導(dǎo)全面的免疫應(yīng)答、提供同種異株交叉保護(hù)作用、易于制備多價疫苗、兼有預(yù)防和治療作用等特點在多種疾病的防治中顯示出巨大的應(yīng)用潛力。而與傳統(tǒng)疫苗相比，活減毒鼠傷寒沙門菌這一新型口服疫苗載體釋放系統(tǒng)亦具有無需純化抗原，無需佐劑，可避免抗原在胃內(nèi)的降解和變性等優(yōu)點。大量試驗證實，減毒傷寒沙門菌作為疫苗免疫載體接種人體是安全的，具有廣闊的實際應(yīng)用價值。 研究表明，單一的H．pylori保護(hù)性抗原組分免疫效果并不滿意，多價疫苗將是今后H．pylori疫苗研究的方向。本研究旨在將H．pylori疫苗主要候選抗原UreB、NapA(HP-NAP亞基)及HpaA基因融合，并將其亞克隆入真核表達(dá)載 博士學(xué)位論文 體PIRES，然后導(dǎo)入活減毒鼠傷寒沙門菌SL7207，構(gòu)建UreB一NapA一HpaA口服 重組DNA疫苗，評價其免疫原性，為H. Pytori口服DNA疫苗的研制奠定基礎(chǔ)。 二、研究目的 l、構(gòu)建ureB、n即A、hPaA原核表達(dá)系統(tǒng)，誘導(dǎo)表達(dá)并純化相應(yīng)蛋白UreB、 N即A、HPaA，制備相應(yīng)蛋白抗血清，評價其免疫原性; 2、構(gòu)建并鑒定融合基因ureB一n叩刁一hPaA，將其導(dǎo)入真核表達(dá)載體PIRES， 轉(zhuǎn)化活減毒鼠傷寒沙門菌SL7207，構(gòu)建UreB一NapA一HpaA口服重組DNA疫苗。 三、研究內(nèi)容 第一部分 制備H.Pylori基因組DNA，以此為模板，引物ureBF:5’一GGAATTCTCG CAT GAA GTA GAA CAI，GA一3‘，ureBR:5‘一CCC AAG CTT Al，C CAC GAA CAC Al，GGI人AG一3’;nop刁F:5’·GCGAATTCGCATTTGCAAGCGGATGCGAT C·3’，nop月R:5’一GC AAG CTT AGC CAA ATG GGC TTG CAG CAT CC一3‘; hP喇F:5’一GC GAA TTC GAA AGG TAG TTT GGC AAT CGT-3‘，徹aAR:5‘一GC AAG CTT GCT TAA CTC TTT oGTA燈燈G CAeC一3’，PeR擴(kuò)增ure刀，n叩月 及徹酬基因片段，分別T-A克隆入載體pMD 18一T，轉(zhuǎn)化受體菌XLI一Blue，篩 選抗性克隆擴(kuò)增，堿法抽提質(zhì)粒，EcoRI及Hindm酶切回收目的片段，分別亞 克隆入原核表達(dá)載體pET-22b，構(gòu)建并鑒定重組質(zhì)粒pET-22b一ureB，pET-22b- naP，4，PET-22b一hPaA。重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化表達(dá)受體菌BLZI一codonPlus⑧(DE3)， 篩選抗性克隆，0.5 mmol/L IpTG誘導(dǎo)表達(dá)相應(yīng)蛋白UreB、NapA、HpaA， SDS一隊GE檢測蛋白表達(dá)情況。將純化蛋白腹部皮下注射免疫小鼠(1/w/2)， 制備相應(yīng)抗血清并Westem blot鑒定，EUSA測定抗血清效價。 第二部分 以H.刃l(wèi)ori基因組DNA為模板，引物ureBF:5幾CGG CTC GAG ATG AAA AAG戶a，TAGCAGAAAAG一3‘，ureBR:5‘一GCTAGCGAAAATGCTAAAGAG TTGC一3’;nop月F:5‘一GCT AGC Al，G AAAACATTTGAAAI，TCT-3‘，nop注R: 5‘一ACT AGT AGC CAA Al，G GGC TTG CAG CA一3’:hPaAF:5‘一ACT AGT ATG AAAAAAGGTAGTTTGGC·3‘，hPaAR:5‘一ACGCGTCI人CTTTCGTTTTTT CAT TTC Ac一3‘，PcR擴(kuò)增ureB，n叩A(chǔ)及hPaA基因全長序列(ureB、n叩月分 一一一一一半 .5. 博士學(xué)位論文 別去除終止密碼子以利融合蛋白表達(dá))，分別T-A克隆入載體pMD 18一T，構(gòu)建重 組質(zhì)粒pMD一ureB，pMD一n叩月，pMD一hPaA，鑒定插入方向并測序。 依次連接ureB，n即月及hPaA，構(gòu)建并鑒定融合基因ureB一nc少月一hPaA，亞克 隆入真核表達(dá)載體PIRES，構(gòu)建重組質(zhì)粒PIRES一ureB一n即刁一hPaA，酶切鑒定。 將重組質(zhì)粒PIREs一ureB一n即A一hPaA轉(zhuǎn)染COS一7細(xì)胞，Westem blot分析融合 蛋白表達(dá)情況。 將PIRES一ureB一n即注一hPaA轉(zhuǎn)化活減毒鼠傷寒沙門菌LBSO00進(jìn)行甲基化修 飾，篩選抗性菌落，選擇性擴(kuò)增，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，進(jìn)一步電擊轉(zhuǎn)化終宿 主菌SL7207，PCR及雙酶切鑒定。 四、研究結(jié)果 第一部分 PCR自H刃l(wèi)ori基因組DNA中分別擴(kuò)增出一約1 560 bp，408 bp，687 bp 產(chǎn)物，與預(yù)計相符。重組質(zhì)粒pET-22b一ureB經(jīng)BamHI酶切后獲得一約940bP 片段;
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

圖1H.P.vlori定植和致病示意圖matierePresentationofthestomaehmueosaeolonizedbyH.Pylori，showingthemainetorsinvolvedincolonizationanddisease.AdaPtedfromREE46.

HP一NAP為反應(yīng)性氧自由基的強(qiáng)刺激劑，其與特異受體結(jié)合，級聯(lián)激活細(xì)胞內(nèi)事件，胞質(zhì)ca2+濃度及蛋白質(zhì)磷酸化增加，進(jìn)而通過PTx敏感途徑(包括ERK和P38一MAPK)，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞表面功能性NADPH氧化酶的富集(圖2)。HP一NAP亦可穿過上皮單層，誘導(dǎo)肥大細(xì)胞的激活，進(jìn)一步支持HP一NAP在H.Pytori感染過程體內(nèi)炎癥事件的觸發(fā)和維持中具有重要作用。圖2中性粒細(xì)胞激活蛋自(HP一NAP)作用機(jī)制Fig.2SehemeoftheintraeellulareventsinvolvedintheHP一NAPaetivationofhumanleukocytes.AdaPtedfromREE46.HP一NAP高度保守，其編碼基因幾乎存在于所有H.Pytori菌株，但不同H.Pytori菌株體外表達(dá)HP一NAP的水平存在很大差異，這一特點與VacA很相似。Satin等檢測了35例H.刃l(wèi)ori感染者血清，結(jié)果60%HP一NAP抗體陽性。Kiminel等對6例胃炎患者血清測定，結(jié)果均存在抗HP一NAP抗體。表明H.Pylori感染后，能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生抗HP一NAP特異性免疫保護(hù)反應(yīng)。新近

AureBPCR擴(kuò)增結(jié)果
【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 黃孝天;沙門菌非典型菌毛在BALB/c小鼠中的免疫原性[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;2005年03期

2 馬延濱;高閃電;叢國正;�；菔|;;沙門菌載體重組疫苗的研究進(jìn)展[J];中國獸醫(yī)雜志;2011年06期

3 吳華,高宏偉,朱來華,徐彪,王樹峰,梁成珠,畢建秀;應(yīng)用復(fù)合PCR方法檢測沙門菌的研究[J];中國獸醫(yī)科技;2003年12期

4 姜秀云,王麗娟,李芳;連云港地區(qū)1994～1996年志賀菌,沙門菌型分布分析[J];蘇州醫(yī)學(xué)院學(xué)報;1998年10期

5 王鳴柳;分子生物學(xué)技術(shù)在沙門菌研究中的應(yīng)用[J];廣西醫(yī)學(xué);2002年03期

6 馬越,陳鴻波;食源性非傷寒沙門菌的感染[J];中國藥事;2002年03期

7 陳汝光,朱美玲,黃龍,伍新堯,羅超權(quán);聚合酶鏈反應(yīng)與限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性檢測沙門菌[J];中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志;1997年02期

8 王禮文,張莉,張力;吡咯烷酮酶試驗在沙門菌鑒定中的應(yīng)用[J];中國衛(wèi)生檢驗雜志;2004年01期

9 余幗華;;沙門菌鞭毛蛋白可用于制備霍亂菌苗[J];國際生物制品學(xué)雜志;1989年05期

10 劉明秋;用沙門菌作為重組活疫苗載體的研究進(jìn)展[J];國外醫(yī)學(xué).預(yù)防.診斷.治療用生物制品分冊;2001年04期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 孫波;幽門螺桿菌多價口服核酸疫苗實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

2 白楊;表達(dá)幽門螺桿菌粘附素保守區(qū)的減毒鼠傷寒沙門菌的構(gòu)建及其免疫治療作用的研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2002年

3 何永林;GLS/IL-12重組沙門菌抗腫瘤的實驗研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2007年

4 馮曄;沙門菌各血清型基因組序列和致病性的比較[D];浙江大學(xué);2009年

5 李傳友;結(jié)核分枝桿菌黏附素HBHA的制備及其應(yīng)用研究[D];北京市結(jié)核病胸部腫瘤研究所;2005年

6 范鑫;奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌亞單位疫苗的研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

7 徐燦;幽門螺桿菌尿素酶B和黏附素A核酸疫苗的研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

8 邱馳;影響食品安全的食源性致病菌快速檢測技術(shù)與風(fēng)險分析研究[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

9 江中明;減毒沙門菌靶向介導(dǎo)TIP30和干擾素-γ基因抗頭頸癌的實驗研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2004年

10 祝建波;動物腹瀉重組抗原基因的克隆與表達(dá)及植物疫苗載體的初步研究[D];華南熱帶農(nóng)業(yè)大學(xué);2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 王瑜;胸膜肺炎放線桿菌自轉(zhuǎn)運黏附素序列分析及其黏附活性研究[D];石河子大學(xué);2011年

2 計群;自轉(zhuǎn)運黏附素Apa1功能區(qū)與豬肺組織互作蛋白的篩選與序列分析[D];吉林大學(xué);2013年

3 余澤波;傷寒及甲型副傷寒沙門菌耐藥監(jiān)測、多重耐藥主動外排基因acr的檢測和表達(dá)與全基因序列分析[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2002年

4 張軍;表達(dá)人受精素β去整合素結(jié)構(gòu)域的重組沙門菌疫苗株的構(gòu)建[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2003年

5 白薇;PCR-RDB方法檢測空腸彎曲菌、結(jié)腸彎曲菌和沙門菌及初步應(yīng)用研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2000年

6 喬紅偉;豬霍亂沙門菌疫苗株介導(dǎo)的豬瘟基因疫苗及實驗免疫研究[D];新疆農(nóng)業(yè)大學(xué);2003年

7 宋力;脂多糖、燒傷大鼠PMN與血清對內(nèi)皮細(xì)胞骨架蛋白和鈣黏附素功能的影響[D];中國人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué);2003年

8 馮昊;金黃色葡萄球菌凝集因子A的表達(dá)及免疫原性研究[D];黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué);2008年

9 楊若耶;豬鏈球菌2型39KD細(xì)胞壁蛋白的黏附作用[D];甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

10 朱勝梅;環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增同時檢測沙門菌和志賀菌的研究[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

本文編號：2859019