目前，過敏性疾病已成為全球關注的公共衛(wèi)生問題。塵螨廣泛存在于人類居室環(huán)境的塵埃中，它作為一種重要的變應原在變態(tài)反應學研究中受到高度重視。塵螨可引起支氣管哮喘、過敏性鼻炎、過敏性皮炎等多種變態(tài)反應性疾病，嚴重影響人類健康。而塵螨中包含的引起變態(tài)反應的成分-塵螨變應原在研究中一直受到高度關注。并且，隨著探索的深入,不斷有新的塵螨變應原被識別和發(fā)現，這極大地加深了人類對塵螨變應原的認識，推動了塵螨過敏性疾病診斷、預防和治療的進步。通常寄生蟲的HSPs作為一種蛋白質有較好的免疫原性，一方面，有誘導宿主產生變態(tài)反應，成為粉塵螨變應原的潛在可能；另一方面，有作為抗原用于塵螨過敏性疾病特異性免疫預防和治療的潛力。因此，本課題組在既往研究的基礎上，選擇粉塵螨熱休克蛋白60（Heat shock protein60，Hsp60）為研究對象，以期探索和發(fā)現粉塵螨新的變應原組分，并對其免疫學特性進行初步研究。 研究目的： 以粉塵螨Hsp60為研究對象，測定和分析它的cDNA序列，克隆表達出高純度的Hsp60蛋白片段，用重組蛋白與塵螨過敏病人血清反應，對該蛋白是否可能是變應原進行初步評估。 研究方法： 1、粉塵螨總RNA的提取用Trizol提取總RNA。 2、粉塵螨cDNA的合成及PCR擴增以提取的RNA為模板逆轉錄合成cDNA，根據與塵螨相近物種Hsp60蛋白的特征性和保守序列設計簡并性引物，以cDNA為模板PCR擴增Hsp60基因片段。 3、測序及氨基酸序列分析將擴增獲得的PCR產物進行測序，將測序后堿基序列編碼的氨基酸序列進行同源性分析，并對氨基酸序列進行親水性區(qū)域分析。 4、粉塵螨Hsp60基因片段的擴增和TA克隆根據測序結果設計特異性引物，并加入酶切位點，PCR擴增Hsp60基因片段，然后連接到PMD18-T載體上，并將陽性重組質粒送公司測序。 5、粉塵螨Hsp60基因片段亞克隆將TA克隆質粒和pET-32a(+)質粒分別雙酶切，然后將目的基因片段連接在pET-32a(+)上，構建pET-32a(+)-Hsp60原核表達載體。 6、重組蛋白的表達與純化將陽性重組質粒轉化入大腸桿菌表達系統進行誘導表達，表達產物經SDS-PAGE電泳觀察表達情況，并進行可溶性分析。將表達的重組蛋白經Ni-NTA層析柱純化。 7、重組蛋白Western blot鑒定以塵螨過敏病人血清為一抗與純化的重組蛋白反應，以羊抗人IgE-HRP為二抗，最后用ECL化學發(fā)光法顯示Western blot結果。 8、重組蛋白質譜分析將純化的重組蛋白SDS-PAGE電泳條帶切下后送公司做蛋白質譜檢測。 研究結果： 1、提取粉塵螨的RNA，逆轉錄合成cDNA，用簡并引物成功擴增出約520bp大小的PCR產物。測序結果顯示其堿基序列與Achromobacter Xylosoxidans Hsp60相似度為86%，其堿基編碼的氨基酸與Advenella Mimigardefordensis Hsp60相似度可達92%。 2、成功的構建了原核表達載體pET-32a(+)-Hsp60，并表達出大小為37KD左右的重組蛋白，經Ni-NTA層析柱純化后獲得純度較高的可溶性目的蛋白。 3、純化的重組蛋白經Western blot鑒定，能與塵螨過敏病人血清中的IgE反應。 4、質譜分析結果顯示：重組蛋白為Hsp60。 結論： 1、結合免疫印跡、蛋白組學分析技術對塵螨新變應原進行分析和篩選是一種有效的方法，為新的塵螨變應原的發(fā)現提供了一種新的技術線路。 2、本研究通過簡并引物PCR和基因測序方法首次確定了粉塵螨Hsp60部分cDNA序列。 3、通過基因克隆和大腸桿菌原核表達技術成功表達出粉塵螨Hsp60（片段）重組蛋白。且它能與粉塵螨過敏患者血清的IgE發(fā)生特異性結合，從而獲得了Hsp60可作為粉塵螨變應原的重要證據。
【學位單位】：廣州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2014
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

RNA 的濃度為 139μg/ml。1%瓊脂糖凝膠電泳（圖 1），可見有 28S、18S、5S 三條帶，顯示 RNA 完整性較好。圖1 粉塵螨總RNA的提取Fig.1 Extraction of RNA from Dermatophagoides farinae2 粉塵螨 Hsp60 基因片段的擴增和序列分析2.1 Hsp60 基因片段的 PCR 擴增用簡并引物對粉塵螨 cDNA 進行初次 PCR 擴增，產物經瓊脂糖凝膠電泳，未見明顯目的 DNA 條帶。故將初次擴增產物稀釋 10 倍，用稀釋后產物做模板再次擴增，PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳，可見明顯的大小約 520 bp 的 DNA 擴增條帶，結果如圖 2 所示。（上述 PCR 擴增反應共重復 3 次，均得到大小相同的擴增產物。）

粉塵螨 Hsp60 基因片段 PCR 結果R amplification of Dermatophagoides DNA Marker DL2000; Lane 1: PCR的測序與分析ACGCGGTATCGACAAAGCCGTTACTGCAGCAAGGAAATCGCCCAGGTTGGTTCGACGCCATGGACAAAGTAGGCAAGGGCTTGACGTGGTTGAAGGCATGCAATCAAGCAGGTTTCCGTACTGGAAGACCTCTGCTGCCCATCCTGGAACAGGTTGGGGCGAAGCCCTGGCTACGCTGGTTGACCAGGATTTGGTGACT （下劃

圖 3 粉塵螨氨基酸序列同源性分析結果Fig.3 Homology analysis for amino acid sequence of Dermatophagoides farinae2.2.4 蛋白質構成、性質與親水性分析結果：Number of amino acids: 173Molecular weight: 18691.4Theoretical pI: 4.70Amino acid composition:Ala (A) 15 8.7%Arg (R) 5 2.9%Asn (N) 8 4.6%Asp (D) 16 9.2%Cys (C) 1 0.6%Gln (Q) 5 2.9%Glu(E) 11 6.4%
【參考文獻】

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本文編號：2859265