第一部分酸敏感離子通道在培養(yǎng)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)及功能 目的：酸敏感離子通道（acid-sensing ion channels，ASICs）是一種配體門控型離子通道，屬于退化蛋白/上皮鈉通道超家族（DEG/ENaC）成員。自1980年在神經(jīng)元細(xì)胞膜上首次被發(fā)現(xiàn)報(bào)道后，受到越來越多的關(guān)注。神經(jīng)系統(tǒng)中，ASICs廣泛分布于前腦、中腦、腦干、腦橋、小腦、上丘腦、脊髓等部位，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)元外也有大量的ASICs表達(dá)，包括神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞。不同的ASIC亞單位在多種生理病理過程中發(fā)揮著重要作用，包括缺血性腦損傷、疼痛、學(xué)習(xí)記憶、癲癇、多發(fā)性硬化、偏頭痛、腸應(yīng)激綜合癥等。已有研究表明，ASICs與免疫炎癥具有密切的關(guān)系，但小膠質(zhì)細(xì)胞上是否有ASICs的表達(dá)目前尚無報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)旨在從基因水平和蛋白水平檢測ASICs的表達(dá)，并研究該通道在小膠質(zhì)細(xì)胞上的特性。 方法：采用RT-PCR的方法在mRNA水平檢測小膠質(zhì)細(xì)胞ASICs的表達(dá)；實(shí)時(shí)定量PCR定量分析ASIC1、2a、3三種亞型在小膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)的比例；western blotting方法在蛋白水平檢測小膠質(zhì)細(xì)胞ASICs的表達(dá)；細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記的方法確定ASICs三種亞型在小膠質(zhì)細(xì)胞上的分布；全細(xì)胞膜片鉗檢測小膠質(zhì)細(xì)胞ASICs電流特性；鈣離子成像的方法檢測小膠質(zhì)細(xì)胞上ASICs通道的離子通透性。 結(jié)果：（1）從基因和蛋白水平分別證實(shí)ASIC1、2a、3三種亞型在小膠質(zhì)細(xì)胞上均有表達(dá)，實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果表明，ASIC1表達(dá)量最多，ASIC3次之，ASIC2a最少。其中，ASIC1和ASIC3在胞漿和胞核中均有分布，而ASIC2a主要分布在胞核。（2）LPS刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞胞外pH值快速降低可誘發(fā)ASIC樣電流，該電流具有pH依賴性，pH0.5為6.00±0.04；此外，該電流可被100μM阿米洛利抑制，抑制率為63.15%±6.9%；（3）胞外酸化可引起LPS刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)鈣升高，該作用可被100μM阿米洛利和10nM PcTx1抑制，抑制率分別達(dá)到了61.7%±4.8%和47.3%±6.2%。 結(jié)論：小膠質(zhì)細(xì)胞上存在ASICs的表達(dá)，其中ASIC1擁有最為豐富的轉(zhuǎn)錄基因。LPS 刺激小膠質(zhì)細(xì)胞，易化胞外快速酸化誘發(fā)的內(nèi)向電流和胞內(nèi)鈣升高。 第二部分酸敏感離子通道在培養(yǎng)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制 目的：炎癥發(fā)生時(shí)常常伴有組織的酸化，即病變處pH值低于正常，這種低pH環(huán)境被認(rèn)為是炎癥反應(yīng)的標(biāo)志，感受這種變化就能在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮作用。而機(jī)體中確有一種酸敏感離子通道，能夠感受細(xì)胞外pH的下降，即被細(xì)胞外H+激活，通過對Na+和Ca2+的通透形成內(nèi)向電流，導(dǎo)致細(xì)胞膜去極化，產(chǎn)生興奮性效應(yīng)。目前已經(jīng)證實(shí)ASICs確實(shí)在炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。至于ASICs在小膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)炎癥的免疫調(diào)節(jié)中的作用還不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在研究ASICs在LPS刺激下對小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)和劃痕遷移中的作用。 方法：采用western blotting方法觀察LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞iNOS和COX-2的表達(dá)，利用ASICs通道非特異性阻斷劑amiloride和ASIC1a特異性阻斷劑PcTx1研究ASICs在其中發(fā)揮的作用；細(xì)胞免疫熒光標(biāo)記的方法觀察劃痕誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移，利用ASICs通道非特異性阻斷劑amiloride和ASIC1a特異性阻斷劑PcTx1研究ASICs在其中發(fā)揮的作用。 結(jié)果：（1）LPS誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞ASIC1和ASIC2a蛋白表達(dá)增加，且ASIC1膜蛋白表達(dá)增加。（2）LPS誘導(dǎo)iNOS和COX-2的表達(dá)，該作用可被ASICs通道阻斷劑阿米洛利及PcTx1抑制。（3）ASICs通道阻斷劑阿米洛利及PcTx1通過抑制ERK磷酸化來抑制劃痕誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞遷移。 結(jié)論：ASICs參與了LPS誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的表達(dá)和劃痕誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞的遷移。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R363
【文章目錄】：
縮略詞表
中文摘要
Abstract
前言
第一部分 酸敏感離子通道在培養(yǎng)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá)及功能及
    一 材料和方法
    二 結(jié)果
    三 討論
    小結(jié)
第二部分 酸敏感離子通道在培養(yǎng)大鼠小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)中的作用及機(jī)制
    一 材料和方法
    二 結(jié)果
    三 討 論
    小結(jié)
全文總結(jié)
本文的創(chuàng)新點(diǎn)
展望
參考文獻(xiàn)
綜述
    參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間已發(fā)表和待發(fā)表的論文
致謝

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2858959