研究背景 肛門失禁是持續(xù)性或反復(fù)發(fā)作的不能感知腸內(nèi)容物性狀或不能控制腸內(nèi)容物的排出,包括液態(tài)、氣態(tài)、固態(tài)的腸內(nèi)容物,是復(fù)雜的、多因素導(dǎo)致的排便功能紊亂,表現(xiàn)為對氣體或糞便控制能力的損害,導(dǎo)致排便次數(shù)增多,常有腹瀉。這些臨床癥狀經(jīng)常導(dǎo)致患者拒絕參與社交活動(dòng)并嚴(yán)重影響患者的日常生活。雖然相繼提出多種手術(shù)及非手術(shù)治療方式,但各有其局限性與缺點(diǎn),頑固性肛門失禁仍然是內(nèi)、外科臨床上十分難處理的問題。為此,我們試圖研制出一種制作肛門失禁動(dòng)物模型的方法,以期望為制作肛門失禁動(dòng)物模型提供一種新的思路,為治療肛門失禁疾病的研究做好基礎(chǔ)性工作。鑒于國內(nèi)外學(xué)者目前采用的造模方法,研制的新造模方法期望達(dá)到的目標(biāo)主要有:①操作簡單,無需昂貴的實(shí)驗(yàn)儀器及實(shí)驗(yàn)試劑,易于推廣;②微創(chuàng)操作,動(dòng)物死亡率低;③造模效果確切、穩(wěn)定。 根據(jù)既往研究成果,肛門外括約肌在排便節(jié)制中扮演著重要的角色,其支配神經(jīng)為骶神經(jīng)。Cosovic E等研究發(fā)現(xiàn)局部注射高濃度局麻藥物,可使神經(jīng)在1周后出現(xiàn)變性。局麻藥物神經(jīng)損害程度呈濃度依賴性,其濃度愈高,損害程度愈重,直至運(yùn)動(dòng)、感覺功能永久性喪失。另外,當(dāng)藥物濃度達(dá)到臨界水平時(shí),局麻藥具有去污劑性質(zhì),可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)破壞,此過程呈不可逆性改變。神經(jīng)局部注射體積分?jǐn)?shù)0.99乙醇,可導(dǎo)致末梢神經(jīng)阻滯,應(yīng)用于三叉神經(jīng)痛的治療�；谏显V理論,我們初步探索了一種新的肛門失禁動(dòng)物模型的制作方法,通過功能性定位肛門外括約肌支配神經(jīng),局部注射神經(jīng)毒性藥物,選擇性破壞肛門外括約肌支配神經(jīng),使其效應(yīng)肌,即肛門外括約肌發(fā)生功能障礙,成功制作出肛門失禁的動(dòng)物模型。 目的 基于操作簡單、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、微創(chuàng)操作、造模效果確切穩(wěn)定的理念,研制出一種制作肛門失禁動(dòng)物模型的新方法,以期望為制作肛門失禁動(dòng)物模型提供一種新的思路,為治療肛門失禁疾病的研究做好基礎(chǔ)性工作。 方法 1、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組8月齡健康成年雄性新西蘭兔30只,體質(zhì)量2.0-2.5 kg,普通級飼養(yǎng)。30只新西蘭兔按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)平均分為5組,對照組A(n=6),局部注射藥物為生理鹽水,術(shù)后8周取局部組織做病理檢查;實(shí)驗(yàn)組B(n=6),局部注射藥物為50g╱L羅哌卡因,術(shù)后4周取局部組織做病理檢查;實(shí)驗(yàn)組C(n=6),局部注射藥物為50g╱L羅哌卡因,術(shù)后8周取局部組織做病理檢查;實(shí)驗(yàn)組D(n=6),局部注射藥物為體積分?jǐn)?shù)0.99乙醇,術(shù)后4周取局部組織做病理檢查;實(shí)驗(yàn)組E(n=6),局部注射藥物為體積分?jǐn)?shù)0.99乙醇,術(shù)后8周取局部組織做病理檢查。 2、動(dòng)物的麻醉本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的麻醉均采用30g╱L戊巴比妥1ml/kg靜脈注射麻醉。 3、測術(shù)前動(dòng)物麻醉狀態(tài)下肛管內(nèi)靜息壓力(anal canal resting pressure,ARP)固定動(dòng)物,肛門周圍及骶部脫毛,肛管內(nèi)置入測壓水囊,連接三通管、壓力標(biāo)定表、壓力電信號(hào)轉(zhuǎn)換器、十六道生理信號(hào)采集系統(tǒng)PowerLab 16/30(ML880)、Dual Bio Amp/Stimulator(ML408),測動(dòng)物麻醉狀態(tài)下ARP。 4、功能性定位雙側(cè)第4薦神經(jīng)并對肛門外括約肌行肌電圖(electromyography,EMG)檢查在離穿刺部位較遠(yuǎn)處安置無關(guān)電極一枚,與穿刺針及脈沖器連接形成環(huán)路,在肛門外括約肌上置2枚感應(yīng)電極。將刺激電流開至1.5mA,脈沖頻率1 Hz。在兔骶部捫及骶骨下部,按照第4薦神經(jīng)的解剖部位進(jìn)行定位穿刺。當(dāng)與刺激電極相連的穿刺針進(jìn)針達(dá)一定深度,出現(xiàn)與脈沖電流同步的肛門外括約肌收縮運(yùn)動(dòng)時(shí),表明穿刺針接近或抵達(dá)第4薦神經(jīng),此時(shí)將脈沖電流關(guān)至0.5mA,肛門外括約肌仍在收縮運(yùn)動(dòng),表明已刺中第4薦神經(jīng)。記錄電極刺入的位置、方向、深度。調(diào)整刺激電流參數(shù)設(shè)置為方波,頻率1Hz,波寬50us,強(qiáng)度5mA。記錄肛門外括約肌的EMG圖形。 5、神經(jīng)周圍注射藥物在維持上述電流刺激及監(jiān)測肛管內(nèi)壓力變化的情況下,于定位好的第4薦神經(jīng)處,回抽無血液,在兩側(cè)第4薦神經(jīng)處緩慢注射藥物。A組注射生理鹽水0.5ml;B、C組注射50g/L羅哌卡因0.1ml/kg+腎上腺素(1:250000);D、E組注射體積分?jǐn)?shù)0.99乙醇0.5ml+腎上腺素(1:250000)。均分兩側(cè)第4薦神經(jīng)處注射。 6、測術(shù)后4周麻醉狀態(tài)下B組、D組動(dòng)物ARP麻醉并固定動(dòng)物,肛門周圍及骶部脫毛,肛管內(nèi)置入測壓水囊,連接三通管、壓力標(biāo)定表、壓力電信號(hào)轉(zhuǎn)換器、十六道生理信號(hào)采集系統(tǒng)PowerLab 16/30(ML880)、Dual BioAmp/Stimulator(ML408),測動(dòng)物麻醉狀態(tài)下ARP。 7、對術(shù)后4周麻醉狀態(tài)下B組、D組動(dòng)物行肛門外括約肌EMG檢查在離穿刺部位較遠(yuǎn)處安置無關(guān)電極一枚,與穿刺針及脈沖器連接形成環(huán)路,在肛門外括約肌上置2枚感應(yīng)電極。將刺激電流開至1.5 mA,脈沖頻率1 Hz。按記錄的電極刺入的位置、方向、深度刺入,觀察肛門外括約肌的運(yùn)動(dòng)情況,必要時(shí)將電流刺激強(qiáng)度增加至5mA。記錄肛門外括約肌的EMG圖形。 8、測術(shù)后8周麻醉狀態(tài)下A組、C組、E組動(dòng)物ARP麻醉并固定動(dòng)物,肛門周圍及骶部脫毛,肛管內(nèi)置入測壓水囊,連接三通管、壓力標(biāo)定表、壓力電信號(hào)轉(zhuǎn)換器、十六道生理信號(hào)采集系統(tǒng)PowerLab 16/30(ML880)、Dual BioAmp/Stimulator(ML408),測動(dòng)物麻醉狀態(tài)下ARP。 9、對術(shù)后8周麻醉狀態(tài)下A組、C組、E組動(dòng)物行肛門外括約肌EMG檢查在離穿刺部位較遠(yuǎn)處安置無關(guān)電極一枚,與穿刺針及脈沖器連接形成環(huán)路,在肛門外括約肌上置2枚感應(yīng)電極。將刺激電流開至1.5 mA,脈沖頻率1 Hz。按記錄的電極刺入的位置、方向、深度刺入,觀察肛門外括約肌的運(yùn)動(dòng)情況,必要時(shí)將電流刺激強(qiáng)度增加至5mA。記錄肛門外括約肌的EMG圖形。 10、標(biāo)本的獲取及處理術(shù)后4周處死B組、D組動(dòng)物,術(shù)后8周處死A組、C組、E組動(dòng)物,解剖分離肛門外括約肌、注射藥物部位第4薦神經(jīng)根及神經(jīng)周圍組織,仔細(xì)觀察大體形態(tài)學(xué)改變。取肛門外括約肌、神經(jīng)周圍組織置于4%甲醛溶液中固定,常規(guī)石蠟包埋,切片厚度10um,HE染色,于光學(xué)顯微鏡下觀察注射藥物部位第4薦神經(jīng)周圍組織、肛門外括約肌組織形態(tài)學(xué)變化。取注射藥物部位第4薦神經(jīng),大小約1.0mm×1.0mm×1.0mm,立即投放至4℃預(yù)冷的30g╱L戊二醛溶液固定,再放置4℃保存,逐級乙醇脫水,環(huán)氧樹脂包埋,切片厚度60nm,鉛鈾染色,于透射電鏡下觀察第4薦神經(jīng)根細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。 11、數(shù)據(jù)讀取和分析肛管內(nèi)測壓及肛門外括約肌EMG檢查結(jié)果通過LabChart Reader V6.1讀取并分析 12、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組手術(shù)前、手術(shù)后ARP及手術(shù)前后ARP差值,以x±s形式表示,應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組的術(shù)前、術(shù)后、手術(shù)前后ARP差值的比較采用方差分析,組間的多重比較采用LSD檢驗(yàn),α=0.05作為差異顯著性水平。各組動(dòng)物雙側(cè)肛門外括約肌支配神經(jīng)術(shù)后神經(jīng)EMG檢查EMG改變是否明顯,以計(jì)數(shù)資料形式表示,應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,各組動(dòng)物EMG改變明顯率的比較采用雙向無序R×C表資料的Fisher確切概率法檢驗(yàn)。 結(jié)果 1、動(dòng)物存活情況B組中1只動(dòng)物于術(shù)后立即死亡,其余動(dòng)物均存活至實(shí)驗(yàn)結(jié)束,于獲取標(biāo)本時(shí)被處死。動(dòng)物術(shù)后存活率約為97%。 2、ARP及肛門外括約肌EMG的變化本實(shí)驗(yàn)用手術(shù)前后ARP及神經(jīng)EMG的變化來衡量造模效果。5組動(dòng)物術(shù)前ARP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),術(shù)后ARP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),手術(shù)前后的dARP差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),各實(shí)驗(yàn)組與對照組dARP差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05),實(shí)驗(yàn)組dARP均大于對照組,實(shí)驗(yàn)組間dARP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。手術(shù)前各組動(dòng)物及手術(shù)后對照組動(dòng)物的肛門外括約肌EMG提示第4薦神經(jīng)功能正常;手術(shù)后實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物肛門外括約肌EMG檢查結(jié)果提示:5組動(dòng)物手術(shù)后EMG改變明顯率的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(雙側(cè)P＜0.05),推斷各組動(dòng)物雙側(cè)肛門外括約肌支配神經(jīng)EMG檢查EMG改變明顯率的差異顯著,各組動(dòng)物左側(cè)EMG改變明顯率分別為A組0%、B組100%、C組D組均為83.3%、E組67.7%,右側(cè)EMG改變明顯率分別為A組0%,B組100%,C組、D組、E組均為83.3%。 3、組織學(xué)改變D組、E組神經(jīng)周圍組織中纖維成份明顯增多,少量炎癥細(xì)胞浸潤;A組與B、C組未見明顯異常改變。各組動(dòng)物肛門外括約肌均未見明顯病理改變。 4、神經(jīng)纖維細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察電鏡掃描顯示實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)軸索變性、髓鞘板層結(jié)構(gòu)紊亂、空泡形成;對照組神經(jīng)軸索及髓鞘超微結(jié)構(gòu)正常 結(jié)論 1.肛門失禁動(dòng)物模型構(gòu)建方法有效局部注射神經(jīng)毒性藥物,選擇性破壞肛門外括約肌支配神經(jīng),能夠成功制作出肛門失禁動(dòng)物模型; 2.肛門失禁動(dòng)物模型穩(wěn)定性好在術(shù)后8W時(shí),實(shí)驗(yàn)組動(dòng)物仍符合肛門失禁診斷標(biāo)準(zhǔn),結(jié)合病理檢查結(jié)果,肛門失禁動(dòng)物模型穩(wěn)定; 3.操作簡單,易于推廣本課題選用的實(shí)驗(yàn)試劑及儀器設(shè)備均為實(shí)驗(yàn)室常用試劑及儀器設(shè)備,易于推廣。采用神經(jīng)定位方式,準(zhǔn)確、完整地破壞支配肛門外擴(kuò)約肌的神經(jīng)主干,迅速使肛門外擴(kuò)約肌癱瘓,達(dá)到構(gòu)建肛門失禁動(dòng)物模型的目的,操作過程簡單易行; 4.微創(chuàng)理念這種新型動(dòng)物模型構(gòu)建方法對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的創(chuàng)傷小,術(shù)后動(dòng)物死亡率低。這一微創(chuàng)理念符合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的要求,具有重要的應(yīng)用價(jià)值,不失為肛門失禁動(dòng)物模型造模方法的進(jìn)步。
【學(xué)位單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2009
【中圖分類】：R657.1;R-332
【部分圖文】：

e:手術(shù)前E組動(dòng)物麻醉狀態(tài)下ARP e:TheARPofgrouPEbeforeoPeration圖3 F19.3一1手術(shù)前各組動(dòng)物麻醉狀態(tài)下ARP theARPofeachgrouPbeforeoPeration

第二章肛門失禁動(dòng)物模型的構(gòu)建手術(shù)后通過 PowerLab16/30(ML880)對30只新西蘭兔的麻醉狀態(tài)下A即進(jìn)行監(jiān)測，結(jié)果見圖3一2。卜1.1翻，知..‘......，.勺叨..廳日‘日二氣違臺(tái)固.川巨出翻囚口“翻.曰卜......口目..卜tl卜加.，日口卜今叼到公翻習(xí)。二，.一習(xí)竺竺{aa:手術(shù)后A組動(dòng)物麻醉狀態(tài)下A即 :TheARPofgrouPAafteroPeration日‘日二氣性n固.目引卜曰.，蘇二’;‘合

對30只新西蘭兔的肛門外括約肌進(jìn)行EMG檢查。于刺激電信號(hào)后獲得動(dòng)物肛「〕外括約肌正常收縮運(yùn)動(dòng)的肌電信號(hào)，誘發(fā)電位波幅正常，提示第4薦神經(jīng)功能正常。結(jié)果見圖3一3。a:手術(shù)前A組動(dòng)物麻醉狀態(tài)下肛門外括約肌肌電圖檢查結(jié)果 a:TheEMGofgrouPAbeforeoPeration
【參考文獻(xiàn)】

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1 潘偉華 ,施誠仁 ,金凌宇 ,吳燕 ,吳曄明 ,王玲華;人工泵式肛門括約肌節(jié)制排便的最適腸管約束壓選擇[J];臨床兒科雜志;2001年04期

本文編號(hào)：2858699