很多高免疫反應(yīng)的疾病中都發(fā)現(xiàn)有白細胞介-2受體(IL-2R)陽性細胞的浸澗和聚集，如器官移植排斥、自身免疫性甲狀腺病、Ⅰ型糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等。成人T淋巴細胞白血病細胞和愛滋病病毒HIV感染的細胞表面也含有豐富的IL-2受體。IL2受體陽性淋巴細胞在這些疾病的病理過程中起著關(guān)鍵性作用。因此可以通過IL-2與毒素蛋白的基因融合，表達出融合毒素用以對IL-2受體異常豐富的靶細胞進行特異殺傷，從而達到治療疾病的目的。然而到目前為止，要將此類融合毒素導(dǎo)向藥物推向?qū)嶋H臨床應(yīng)用卻存在一個很大的障礙：大分子異源蛋白在體內(nèi)的免疫原性問題。 本論文分為四個部分。第一部分：融合蛋白IL-2(60)-PEZN，IL-2(60)-PEZNK，IL-2-PEZNM，IL-2-PEZNKM，IL-2-K-PEZNM的基因構(gòu)建與誘導(dǎo)表達。第二部分：5種融合蛋白的快速純化、生物活性測定及融合毒素抗血清的制備。第三部分：融合蛋白IL-2-K-PEZNM的純化制備及藥理活性的初步研究。前三部分的研究對象是IL-2與綠膿毒素的融合，主要目的是利用基因工程和蛋白質(zhì)工程的方法，對本室曾經(jīng)構(gòu)建的融合毒素IL-2(60)-PE40進行一系列的基因突變與改造，探討融合毒素結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，通過對突變體的活性比較，找到最適的構(gòu)建突變?nèi)诤匣虻姆绞�。第四部分：新型融合蛋白IL-2-TNFαM的純化與初步藥理實驗。目的是探索一條構(gòu)建無免疫原性融合毒素的新路 在本文第一部分中，我們通過PCR反應(yīng)、插入突變及缺失突變等方法，構(gòu)建了5種融合蛋白IL-2(60)-PEZN，IL-2(60)-PEZNK，IL-2-PEZNM，IL-2-PEZNKM，IL-2-K-PEZNM的基因，綠膿毒素突變體PEZN是我們利用本實驗室克隆到的PE40基因的特異性所得到的一種突變體形式以求創(chuàng)新，將經(jīng)典的PE40刪除其360-380位氨基酸而得到；突變體PEZNK是將PE40中360-380位氨基酸刪除并以—段擴增于人IgG4基因的富含Lys編碼的基因片段取代而得到；突變體PEZNM是在突變體PEZN的基礎(chǔ)上刪除其C末端最后一個Lys而得到。其中IL-2(60)-PEZN，IL-2(60)-PEZNK的基因分別克隆于表達質(zhì)粒pT7-7的T7啟動子下游，與質(zhì)粒pGP1-2共轉(zhuǎn)化大腸桿菌K38，溫控表達，表達水平分別為18.1％，18.5％；IL-2-PE38M，IL-2-PE38KM，IL-2-K-PE38M的基因分別克隆于本室所構(gòu)建的高效表達質(zhì)粒pLSD13的P_L啟動子下游，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，溫控表達，表達水平分別為19.6％，19.8％，
【學(xué)位單位】：中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：1998
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

圖4通過血清學(xué)反應(yīng)確定的PE38蛋白分子的抗原決定簇區(qū)域的確定為將來消除PE的免疫原性以提高其藥用價值提供以通過點突變在保留其生物活性的同時改變EP分子的抗原決劉日七學(xué)修飾的途徑遮蔽其抗原決定簇，或者將點突變與化學(xué)修。毒素結(jié)構(gòu)域的詳解E的研究多采用蛋白工程的方法.先通過點突變或缺失突變導(dǎo)酸的改變，再研究其生物功能.目前對PE的分子結(jié)構(gòu)及其與較深入的了解.域aI(Amnioacidl一52)

聚合酶削平，得到一個幻』、為3655b拌具有兩個平末端的片段.片段自連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，少量提取質(zhì)粒，酶切，瓊脂糖凝膠電泳篩選鑒定得到重紅封貢粒pNL1.電泳鑒定圖參見圖1.2.對照嘩M10經(jīng)sall和Bgil雙酶切，得到4個片段，2826、科2、255、162Pbs.陽性克隆經(jīng)sall和Bgll雙酶切，得到4個片段，2826、541、285Pbs.姻l除T綠膿毒素結(jié)構(gòu)域bI中功能未知.包括一咐目互酉‘才的Cys在內(nèi)的的15個氨基酸殘基的編碼(即編碼氨基酸殘基365一380膚段的基因)，另外還刪除了結(jié)構(gòu)域nC端5個氨基酸的編碼.這種構(gòu)建方式比目前流行的構(gòu)建方式PE38多刪除了結(jié)構(gòu)域n中的5個氨基酸.操作方式簡潔明了、一步到位

由于是雙酶切定向克隆，重組質(zhì)粒pNLZ重組率很高，其酶切電泳鑒定也較為簡單，同樣以sal+lBal五Hl雙酶切，能夠切下2919，490Pbs兩個片段的質(zhì)粒即為陽性克隆.如圖1.4可見，2，3泳道即為陽性克隆.圖1.5為DNA測序圖譜3.重組質(zhì)拉pL卜[3、pLN4的構(gòu)建3.1通過PCR反應(yīng)擴增人源富含賴氮酸編碼的基因片段A模板:人gIG4重鏈恒定區(qū)基因片段共加28飾s克隆于PBR322質(zhì)粒中.堿變性法小量提取用作模板
【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王敘亭;霍亂毒素B亞單位N-末端附加肽段降低其口服免疫原性[J];國際生物制品學(xué)雜志;1993年05期

2 付譯節(jié);楊莉;劉康;袁創(chuàng);陳縣城;魏于全;;日本血吸蟲tetraspanins胞外環(huán)2編碼基因的克隆表達及其免疫原性的初步研究[J];四川大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2008年06期

3 袁小澎;鄒全明;柏楊;張衛(wèi)軍;郭剛;謝慶華;劉開云;吳超;;幽門螺桿菌多亞單位融合蛋白疫苗的構(gòu)建及免疫特性[J];中國生物制品學(xué)雜志;2007年07期

4 易山;席曉蓉;施銳;楊芳;李敏;李鼎鋒;孫茂盛;;兩種HBsAg/GM-CSF融合蛋白在畢赤酵母中的分泌表達、純化及其免疫原性比較[J];細胞與分子免疫學(xué)雜志;2007年10期

5 藺昕;宗揚勇;許遜;田雨香;陳勛;舒新軍;夏圣;王勝軍;許化溪;邵啟祥;;PTD-eGFP-△E250 mFoxp3融合蛋白的表達與穿膜能力鑒定[J];江蘇大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2009年01期

6 潘志明;文科;游猛;耿士忠;方強;焦新安;;沙門菌鞭毛蛋白增強新城疫病毒融合蛋白在小鼠中的免疫原性[J];生物技術(shù)通訊;2009年06期

7 金亮;王宇;朱愛華;劉景晶;;鼻粘膜免疫融合蛋白Hsp65-6×p277預(yù)防NOD小鼠1型糖尿病的發(fā)生(英文)[J];中國臨床藥理學(xué)與治療學(xué);2006年08期

8 邵鍇;吳廣謀;朱平;張國利;;HIV-Tat蛋白及其相關(guān)藥物研究進展[J];中國實驗診斷學(xué);2008年04期

9 彭世澤;肖紅劍;彭正華;畢妍偉;孫振璐;戴宗祥;高丹丹;徐維明;李智華;李健峰;;重組B群腦膜炎球菌fHBP融合蛋白的表達和免疫原性研究[J];中國生物工程雜志;2011年05期

10 陳春蓮;萬艷平;彭俊;;GFP-HPV18 E2及其突變體融合蛋白在真核細胞內(nèi)的表達與定位[J];華夏醫(yī)學(xué);2007年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 聶凌虎;一組導(dǎo)向融合蛋白的基因工程研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);1998年

2 徐越馳;組氨酸為活性中心的蛋白質(zhì)酪氨酸磷酸酶和細胞自噬標(biāo)記物的研究[D];吉林大學(xué);2010年

3 王玉梅;嵌合降鈣素基因的構(gòu)建及表達[D];中國海洋大學(xué);2005年

4 石炳興;靶向溶栓抗凝雙功能融合蛋白的構(gòu)建表達及在血栓疾病治療中的應(yīng)用研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2004年

5 柏亞鐸;犬瘟熱病毒、犬冠狀病毒入侵宿主細胞機制研究[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2005年

6 張懷;人Hepcidin融合表達載體的構(gòu)建、在大腸桿菌中的表達及制備研究[D];北京化工大學(xué);2005年

7 徐海燕;人BAFF基因轉(zhuǎn)染細胞及其單克隆抗體的生物學(xué)特性[D];蘇州大學(xué);2005年

8 蔣驊;GST-EGFR融合蛋白沖擊樹突狀細胞治療頭頸部鱗狀細胞癌體內(nèi)外實驗觀察[D];浙江大學(xué);2008年

9 劉榮;人4-1BBL/抗CD20融合蛋白增強抗CD3/抗CD20雙功能抗體的細胞毒作用及其機制研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

10 劉偉俠;顯性負性突變體融合蛋白PreS2-TLM-ScFv-HBcDN抑制乙肝病毒復(fù)制的研究[D];浙江大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 席曉蓉;HBsAg/GM-CSF融合蛋白在畢赤酵母中的表達及其免疫原性研究[D];昆明醫(yī)學(xué)院;2005年

2 陳亞波;新城疫病毒HN蛋白與F蛋白結(jié)構(gòu)域共表達對細胞融合的影響[D];浙江大學(xué);2006年

3 陰繼凱;PTD-BCR/ABL SH3融合蛋白對肝細胞腫瘤殺傷作用的研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2004年

4 逄媛;豬源產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌K88、K99，987P、F41雙基因串聯(lián)表達的研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

5 章建楠;嵌合HEV表位的HBcAg顆粒在畢赤酵母中的分泌表達[D];廈門大學(xué);2008年

6 王剛;志賀毒素B亞單位與柯薩奇病毒B組3型VP1融合DNA疫苗的構(gòu)建及其免疫效果的觀察[D];河北醫(yī)科大學(xué);2005年

7 唐鹿群;hTERT與HSP70融合蛋白的構(gòu)建及其對DC分化成熟作用的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2007年

8 夏振娜;Tat融合蛋白制備和初步長期毒性研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2011年

9 牛國宇;登革病毒1-4型E蛋白結(jié)構(gòu)域Ⅲ融合蛋白的表達純化及功能研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2010年

10 陳喆;幽門螺桿菌尿素酶B亞單位和細胞空泡毒素基因的克隆，表達和其融合蛋白免疫反應(yīng)性的研究[D];浙江大學(xué);2002年

本文編號：2857928