慢性乙型肝炎病毒(HBV)是危害人類健康的難題之一,目前全球至少有3.6億乙型肝炎病毒感染者,其中超過三分之一的人群在中國,這些人群面臨著發(fā)展為肝纖維化、肝硬化甚至肝癌的高風(fēng)險。由于慢性乙型肝炎患者對病毒產(chǎn)生不同程度的免疫耐受,以及HBV共價互補環(huán)狀DNA(cccDNA)在肝內(nèi)的持續(xù)存在,現(xiàn)有的抗病毒藥物如干擾素(IFN)和拉米夫定等核苷類似物,只能一定程度抑制HBV的復(fù)制,最終達(dá)不到徹底清除HBV的效果,而且尚有一大部分慢性乙肝患者對上述抗病毒治療無應(yīng)答,因此發(fā)展更為有效的抗病毒藥物是十分迫切。 通常情況下,病毒感染后會通過一系列機制激活免疫系統(tǒng)從而被清除,特別是病毒感染早期誘導(dǎo)表達(dá)Ⅰ型干擾素(IFN-α/IFN-p),I型干擾素不僅能誘導(dǎo)大量的抗病毒蛋白,而且可以激活固有免疫和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)從而發(fā)揮抗病毒作用。漿細(xì)胞樣DC (Plasmacytoid dendritic cells,pDCs)是誘導(dǎo)干擾素-α(IFN-α)表達(dá)的主要天然免疫細(xì)胞,pDCs通過其胞內(nèi)的TLR樣受體(Toll-like receptors,TLR)包括TLR7和TLR9分別識別病毒的單鏈RNA和非甲基化的CpG (cytidine phosphate guanosine oligodeoxynucleotides) DNA從而啟動下游級聯(lián)信號,大量分泌Ⅰ型干擾素。而HBV是一種雙鏈DNA病毒,在其基因組上我們發(fā)現(xiàn)也存在CpG序列,那么HBV是否可以通過自身CpG觸發(fā)TLR9信號從而啟動下游干擾素活化途徑進而清除病毒呢? 基于以上問題考慮,本研究首先篩選HBV基因組來源的CpG,即HBV-CpG,探討其誘導(dǎo)IFN-α表達(dá)的能力,在研究過程中還發(fā)現(xiàn)HBV基因組中存在富含鳥苷的抑制性寡核苷酸(ODN),即HBV-ODN,這些抑制性HBV-ODN可特異性抑制HBV-CpG誘導(dǎo)的IFN-α表達(dá)。進一步研究發(fā)現(xiàn)納米材料PEG-PLA包裹的HBV-CpG,即NP(HBV-CpG),能拮抗HBV-ODN對IFN-a產(chǎn)生的抑制作用,同時探討了NP(HBV-CpG)在預(yù)防和治療乙型肝炎病毒感染中的作用。 在本研究中,我們首先設(shè)計了一系列HBV基因組來源的CpG序列即HBV-CpG,利用ELISA和流式細(xì)胞術(shù)的方法篩選出能誘導(dǎo)健康人PBMCs高表達(dá)IFN-α的HBV-CpG;之后,我們設(shè)計了HBV基因來源的富含鳥苷的抑制性HBV-ODN, ELISA方法驗證其對HBV-CpG誘導(dǎo)IFN-α表達(dá)的能力具有特異性抑制作用,免疫熒光技術(shù)探討了抑制性HBV-ODN的抑制機制；雙乳化法將納米材料包裹HBV-CpG形成NP (HBV-CpG), ELISA方法驗證NP(HBV-CpG)逆轉(zhuǎn)抑制性HBV-ODN介導(dǎo)的抑制活性,ELISA和流式細(xì)胞術(shù)進一步檢測NP(MBV-CpG)誘導(dǎo)乙肝病人PBMCs表達(dá)IFN-a的情況；在小鼠模型中,利用流式細(xì)胞術(shù)檢測野生型小鼠淋巴細(xì)胞的活化情況,放射性免疫法及ELISA法檢測NP(HBV-CpG)聯(lián)合乙肝疫苗接種野生型小鼠后的抗體應(yīng)答；利用高壓注射pAAV/HBV1.2質(zhì)粒構(gòu)建HBV攜帶小鼠模型,流式細(xì)胞術(shù)和ELISA法檢測淋巴細(xì)胞的活化以及Ⅰ型IFN的表達(dá),放射性免疫法檢測NP(HBV-CpG)聯(lián)合乙肝疫苗治療后HBsAg和HBsAb的表達(dá),熒光定量PCR技術(shù)檢測聯(lián)合治療后HBVDNA的表達(dá)情況,免疫組化法檢測聯(lián)合治療后肝臟HBcAg表達(dá)情況,H＆E染色、轉(zhuǎn)氨酶及膽紅素檢測觀察肝臟損傷情況,流式細(xì)胞術(shù)內(nèi)標(biāo)IFN-γ檢測特異性CD8+T細(xì)胞的活化。通過上述研究方法,我們獲得了以下研究結(jié)果： 1. HBV-CpG誘導(dǎo)人pDCs細(xì)胞高表達(dá)IFN-a 首先我們設(shè)計了一系列HBV基因組來源的CpG序列,將其分別刺激健康人PBMCs, ELISA檢測上清IFN-α的表達(dá),由此篩選出高表達(dá)IFN-α的HBV-CpG,進一步流式細(xì)胞術(shù)驗證HBV-CpG是通過誘導(dǎo)Lineagel-, CD123+, HLA-DR+的細(xì)胞即pDCs特異性表達(dá)IFN-α,流式內(nèi)標(biāo)發(fā)現(xiàn)HBV-CpG刺激PBMCs后pDCs胞內(nèi)TLR9表達(dá)上調(diào),TLR7表達(dá)沒有顯著變化,內(nèi)體酸化抑制劑氯喹處理后抑制了HBV-CpG誘導(dǎo)的IFN-α的表達(dá)。以上結(jié)果證明了HBV-CpG誘導(dǎo)人pDCs表達(dá)IFN-α,依賴TLR9而非TLR7的途徑。 2. inhibitory HBV-ODN特異性抑制HBV-CpG誘導(dǎo)的IFN-a的表達(dá) 在HBV基因組上我們同時發(fā)現(xiàn)了一些富集鳥苷的序列,ELISA法證明這些序列具有特異性抑制HBV-CpG誘導(dǎo)IFN-a表達(dá)的能力,該抑制性序列命名為HBV-ODN。我們也發(fā)現(xiàn)這些抑制性HBV-ODN并不能抑制廣譜CpG-2216誘導(dǎo)的IFN-a的表達(dá),為了進一步證明HBV-ODN的抑制機制,我們應(yīng)用免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)HBV-ODN抑制了Gen2.2細(xì)胞對HBV-CpG的攝取及與TLR9的共定位。因此我們認(rèn)為抑制性HBV-ODN特異性抑制了HBV-CpG誘導(dǎo)的IFN-a的表達(dá)。 3. NP(HBV-CpG)逆轉(zhuǎn)HBV-ODN抑制IFN-α的表達(dá)能力 為了逆轉(zhuǎn)HBV-ODN的抑制效應(yīng),我們采用納米材料PEG-PLA包被HBV-CpG,即形成NP(HBV-CpG),當(dāng)NP(HBV-CpG)與HBV-ODN以2：1的比例刺激PBMCs時,IFN-α的表達(dá)顯著提高,而且NP(HBV-CpG)比HBV-CpG具有更強的活化pDCs、NK和T細(xì)胞的能力,進一步研究發(fā)現(xiàn)NP(HBV-CpG)同樣可以誘導(dǎo)乙肝患者來源的PBMCs表達(dá)IFN-α。 根據(jù)以上結(jié)果我們證明HBV-CpG在納米材料包被下可以逆轉(zhuǎn)HBV-ODN抑制IFN-a的能力并且可以誘導(dǎo)乙肝患者PBMCs表達(dá)IFN-α。 4. NP(HBV-CpG)活化野生型小鼠的淋巴細(xì)胞 小鼠體內(nèi)試驗中,通過靜脈注射NP(HBV-CpG)可以顯著提高pDCs和cDCs表面CD40和CD80的表達(dá),以及上調(diào)NK和T細(xì)胞表面CD69和ICOS的表達(dá)。NP(HBV-CpG)體外刺激小鼠脾臟淋巴細(xì)胞,同樣提高了pDCs和cDCs表面CD40和CD80以及NK和T細(xì)胞表面CD69的表達(dá),而且pDCs和cDCs在NP(HBV-CpG)刺激下生存能力增強。以上結(jié)果證明NP(HBV-CpG)體內(nèi)體外均具有活化小鼠淋巴細(xì)胞的能力。 5. NP(HBV-CpG)協(xié)同增強乙肝疫苗的抗體應(yīng)答 NP(HBV-CpG)聯(lián)合rHBsAg疫苗分別免疫BALB/c和C57BL/6小鼠,同時設(shè)空載體聯(lián)合rHBsAg疫苗組、單獨乙肝疫苗組和未處理組做對照,免疫2和4周后放射性免疫法檢測發(fā)現(xiàn),NP(HBV-CpG)聯(lián)合rHBsAg疫苗組抗體應(yīng)答水平顯著提高,ELISA檢測發(fā)現(xiàn)Thl型抗體亞型IgG2a水平也顯著增強。上述結(jié)果證明NP(HBV-CpG)增強乙肝疫苗的抗體應(yīng)答特別是Th1型抗體應(yīng)答。 6. NP(HBV-CpG)促進HBV攜帶小鼠的免疫應(yīng)答 將pAAV/HBV1.2質(zhì)粒高壓注射C57BL/6小鼠,構(gòu)建HBV攜帶鼠模型,NP(HBV-CpG)靜脈處理HBV攜帶鼠顯著提高了cDCs表面CD40和CD80, NK細(xì)胞表面CD69和ICOS,以及CD4+和CD8+T細(xì)胞CD69的表達(dá),并且NP(HBV-CpG)尾靜脈注射HBV攜帶鼠誘導(dǎo)了血清中IFN-α的表達(dá)。以上結(jié)果證明NP(HBV-CpG)具有活化HBV攜帶鼠免疫應(yīng)答的能力。 7. NP(HBV-CpG)聯(lián)合治療有效清除HBV 利用上述高壓注射構(gòu)建的HBV攜帶鼠模型,探討NP(HBV-CpG)對于乙肝病毒的清除作用,將NP(HBV-CpG)聯(lián)合rHBsAg疫苗治療HBV攜帶鼠,經(jīng)過連續(xù)三周的治療,90%的HBV攜帶鼠血清HBsAg被清除,肝臟HBcAg和血清HBVDNA表達(dá)顯著下降,保護性乙肝抗體HBsAb開始表達(dá),并且表達(dá)IFN-y的CD8+T細(xì)胞上調(diào),提示NP(HBV-CpG)促進了CTL功能,同時肝臟HE染色顯示肝臟結(jié)構(gòu)正常,僅有輕微炎性浸潤,血清轉(zhuǎn)氨酶和膽紅素檢測進一步證明HBV攜帶鼠對這種NP(HBV-CpG)聯(lián)合治療是耐受的。 根據(jù)以上結(jié)果我們證明了NP(HBV-CpG)聯(lián)合治療HBV攜帶鼠可以在短期內(nèi)有效清除HBV,并且促進保護性抗體的產(chǎn)生。
【學(xué)位單位】：中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R373.2
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
符號說明
第一章 緒論 HBV天然免疫與天然免疫細(xì)胞漿細(xì)胞樣DC
    1.1.漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞
        1.1.1.pDCs的發(fā)現(xiàn)
        1.1.2.pDCs的發(fā)育
            1.1.2.1.pDCs譜系分化的分子機制
            1.1.2.2.pDCs發(fā)育過程是具有可塑性的
        1.1.3.pDCs的形態(tài)特征
            1.1.3.1.人和小鼠的pDCs表型特征
            1.1.3.2.人和小鼠的pDCs TLR表達(dá)差異
        1.1.4.pDCs調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答
        1.1.5.pDCs與感染性疾病
            1.1.5.1.pDCs與人類免疫缺陷病毒
            1.1.5.2.pDCs與人類肝炎病毒
            1.1.5.3.pDCs與其它病毒
        1.1.6.pDCs與人類自身免疫性疾病
    1.2.HBV持續(xù)性感染
        1.2.1.乙型肝炎病毒的分子病毒學(xué)
        1.2.2.慢性乙型肝炎的疾病進程
        1.2.3.乙型肝炎病毒的固有免疫應(yīng)答
        1.2.4.乙型肝炎病毒與模式識別受體
            1.2.4.1.PRRs活化信號可抑制HBV復(fù)制
            1.2.4.2.通過干擾素誘導(dǎo)抗病毒效應(yīng)抑制HBV復(fù)制
            1.2.4.3.通過TNF-α破壞HBV核衣殼的形成
            1.2.4.4.通過活化PRRs誘導(dǎo)胞內(nèi)的抗病毒信號
        1.2.5.活化天然免疫應(yīng)答的途徑治療慢性乙型肝炎
            1.2.5.1.TLRs和RLRs活化
            1.2.5.2.干擾素治療
        1.2.6.乙型肝炎病毒的獲得性免疫應(yīng)答
    參考文獻
第二章 納米材料包被HBV-CpG對乙型肝炎病毒感染的治療性免疫
    2.1.引言
    2.2.實驗材料和方法
        2.2.1.臨床樣本與實驗動物
        2.2.2.實驗試劑
            2.2.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)菌培養(yǎng)用試劑
            2.2.2.2 碟酸鹽緩沖溶液
            2.2.2.3 細(xì)胞分離試劑
            2.2.2.4 HBV-CpG, HBV-ODN
            2.2.2.5 流式染色用試劑
            2.2.2.6 流式染色用抗體
            2.2.2.7 內(nèi)體酸化抑制劑氯喹
            2.2.2.8 免疫焚光相關(guān)試劑
            2.2.2.9 EUSA檢測試劑
            2.2.2.10 乙型肝炎病毒抗原抗體檢測試劑
            2.2.2.11 乙型肝炎病毒核酸檢測試劑
            2.2.2.12 H-E染色試劑
            2.2.2.13 免疫組化試劑
            2.2.2.14 抗體ELISA檢測試劑
            2.2.2.15 血清轉(zhuǎn)氣酶ALT及膽紅素檢測試劑盒
            2.2.2.16 pAAV/HBVl.2 質(zhì)粒來源
            2.2.2.17 質(zhì)粒抽提試劑盒
            2.2.2.18 Gen2.2 細(xì)胞來源
            2.2.2.19 MS-5細(xì)胞來源
        2.2.3.主要實驗儀器
        2.2.4.試驗方法
    2.3.實驗結(jié)果
        2.3.1.設(shè)計HBV-CpG誘導(dǎo)人PBMCs表達(dá)IFN-α
        2.3.2.HBV-CpG依賴TLR9途徑誘導(dǎo)pDCs表達(dá)IFN-α
        2.3.3.HBV-ODN抑制HBV-CpG誘導(dǎo)的IFN-α的表達(dá)
        2.3.4.NP（HBV-CpG）逆轉(zhuǎn)抑制性HBV-ODN介導(dǎo)的IFN-α抑制表達(dá)
        2.3.5.NP（HBV-CpG）對野生型小鼠的淋巴細(xì)胞具有強烈的活化效應(yīng)
        2.3.6.NP（HBV-CpG）協(xié)同促進rHBsAg疫苗應(yīng)答
        2.3.7.NP（HBV-CpG）誘導(dǎo)HBV攜帶鼠強烈的天然免疫應(yīng)答
        2.3.8.NP（HBV-CpG）聯(lián)合治療HBV攜帶鼠有效清除HBV
    2.4.討論
        2.4.1.HBV基因組的CpG具有誘導(dǎo)IFN-α表達(dá)的能力
        2.4.2.HBV-ODNs可抑制HBV-CpG誘導(dǎo)的IFN-α表達(dá)
        2.4.3.納米材料包被HBV-CpG逆轉(zhuǎn)HBV-ODNs的抑制效應(yīng)
        2.4.4.NP（HBV-CpG）作為佐劑促進乙肝疫苗免疫效果
        2.4.5.NP（HBV-CpG）聯(lián)合乙肝疫苗應(yīng)用于乙型肝炎病毒感染的治療
        2.4.6.總結(jié)
    參考文獻
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