血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelium growth factor，VEGF）是血管內(nèi)皮細 胞的特異絲裂原，具有促進血管內(nèi)皮細胞增殖，加速新血管形成的作用。VEGF是通 過與血管內(nèi)皮細胞表面的特異性受體結(jié)合而發(fā)揮其生物學效應的，在胚胎發(fā)育和心 血管、腫瘤等疾病的發(fā)病和防治中具有重要作用。本文著重從以下三個方面對VEGF 及其受體Flt-1進行了研究。 一、人血管內(nèi)皮生長因子VEGF_(165)在Pichia.pastoris中的表達、純化及其生物學活 性檢測 利用PCR技術(shù)，從phVEGF_(165)·SR真核表達質(zhì)粒擴增出hVEGF_(165) cDNA，構(gòu)建酵母 分泌型表達質(zhì)粒pPIC9K/hVEGF_(165)，分別用單交換和雙交換的方法將目的基因整合到 兩種宿主菌GS115和KM71的染色體上。鑒定轉(zhuǎn)化子表型（His~+Mut~s和His~+Mut~+），G418 加壓篩選多拷貝整合菌株，經(jīng)甲醇誘導在Pichia.pastoris酵母中實現(xiàn)了hVEGF_(165)的 高效分泌性表達，SDS-PAGE顯示其表達量占上清中蛋白總量的60％左右，蛋白質(zhì)定 量分析示其產(chǎn)量約為0.3g/L。ELISA和Western blot表明，表達產(chǎn)物具有hVEGF_(165) 抗原性。 表達產(chǎn)物經(jīng)Hepsrin-sepharose CL6B親和層析純化后，純度可達90％以上。 分別采用HUVEC細胞株MTT比色法及~3H-TdR摻入法對重組hvEGF_(165)的生物學活 性進行了測定，兩種方法結(jié)果完全一致，證實表達產(chǎn)物能特異性刺激HUVEC的增殖， 具有天然VEGF的生物學活性。 二、利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究人血管內(nèi)皮生長因子受體Flt-1的配體結(jié)合域 利用RT-PCR技術(shù)，從HUVEC中擴增出四個截短的Flt-1 cDNA，分別含胞外第 2，1-2，2-3和1-3個loop。構(gòu)建融合表達質(zhì)粒pGBT9/hVEGF_(165)和pGAD424/Flt-1（2）、 pGAD424/Flt-1（1-2）、pGAD424/Flt-1（2-3）、pGAD424/Flt-1（1-3），并將pGBT9/類 質(zhì)粒與pGAD424/類質(zhì)粒兩兩配對轉(zhuǎn)化酵母菌SFY526，采用濾紙法和液體培養(yǎng)法對陽 性克隆進行β-半乳糖苷酶活性分析，結(jié)果顯示，F(xiàn)lt-1（1-3）/hVEGF_(165)轉(zhuǎn)化子2h顯 藍色，平均活性為65.2IU；Flt-1（2-3）/hVEGF_(165)轉(zhuǎn)化子4h顯色，平均活性為50.8IU； Flt-1（1-2）/hVEGF_(165)轉(zhuǎn)化子10h顯色，平均活性為17.5IU；而Flt-1（2）/hVEGF_(165)轉(zhuǎn) 0 第一軍醫(yī)大學九七屆博士學位論文（國家“‘863”計劃資助課題） 化子即使 30h以上也沒有顏色反應。說明不僅 13lOOp能與 VEGF結(jié)合，比其更小的 ］片段2－3100p也具有與其配體結(jié)合的能力，且結(jié)合能力與 1－310Op斥較接近，1－21。＊ 】的結(jié)合力較弱，單獨第2個1剛叩無配體結(jié)合能力。 I 三、FIt－1胞外1－3和2－3looP在PJCbi。P。storjs中的表達、純化及其生物學活 0 性檢測 0 構(gòu)建酵母分泌型表達質(zhì)粒 PPICgK／Fit＊（13）和 PPICgK／Fit一1（2一3），利用 OPIChia．pasto廠is 酵母表達系統(tǒng)實現(xiàn)TFlt 一1（1一3）和Fit 一1（2一3）的高效分泌性表 l 達，SDS－PAGE顯示其表達量占上清中總蛋白的60％以上，產(chǎn)量約為0．35g／L，ELIS＾ 及Western blot表明，表達產(chǎn)物具有良好的抗原性和特異性。 兩種表達產(chǎn)物經(jīng) CM一sepharose fast fbwF 離子又換層析和 Sephacryl一100凝 D 膠過濾層析純化后，純度可這90％以上。 ］固相結(jié)合實驗、固相竟爭性結(jié)合實驗、細胞競爭性結(jié)合實驗、HUVEC細胞株 MTT ］t匕色法及屯呵dR摻入法等檢測方法證實重組 Fit葉（1刁）和 Fit葉Q刁）都具有結(jié)合 IhVEGF；。。的能力和抑制 hVEGF；。。對 HUVEC 勺促增殖功能，其中前者的作用更為明顯， I 但二者相差不大。 本文成功地利用PIChja．pssto汀s酵母表達系統(tǒng)，高效表達了hVEGF；。。，并證實J 其具有天然 VEGF的生物學活性，這對于開發(fā)其在缺血性。。臟病及肢體繼發(fā)性動脈閉J 塞等疾病的防治開辟了廣闊的前景。首次成功地利用酵母雙雜交系統(tǒng)，高效篩選出－ Fit－1胞卜最J、g己體結(jié)合域一2－3looP，并在Pj奶ia．P。sic。is酵母表達系統(tǒng)中買現(xiàn) 了其高效分泌性表達，體外生物學活性實驗證實其具有與VEGF結(jié)合的能力和抑制D VEGF對HUVEC的促增殖功能，這為進一步研究其在動物水平阻斷VEGF的病理作用打 下了良好基礎，為臨床預防和治療腫瘤、糖尿病性視網(wǎng)膜病變等血管生成相關(guān)疾病D 提供了新的手段。
【學位單位】：第一軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2000
【中圖分類】：R392.11
【文章目錄】：
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中文摘要
英文摘要
前言
165在Pichia．pastoris中的表達、純化及其生物學活性檢測'>第一部分 人血管內(nèi)皮生長因子VEGF₁₆₅在Pichia．pastoris中的表達、純化及其生物學活性檢測
    材料方法
    結(jié) 果
    討 論
    小 結(jié)
第二部分 利用酵母雙雜交系統(tǒng)研究人血管內(nèi)應生長因子受體Flt-1的配體結(jié)合域
    材料方法
    結(jié) 果
    討 論
    小 結(jié)
第三部分 人血管內(nèi)皮生長因子受體Flt-1胞外1-3，2-3loop在Pichia．pastoris中的表達、純化及其生物學活性檢測
    材料方法
    結(jié) 果
    討 論
    小 結(jié)
綜述之一 甲基營養(yǎng)型酵母—Pichia．pastoris基因表達系統(tǒng)
綜述之二 血管內(nèi)皮生長因子及其受體的結(jié)構(gòu)和功能
參考文獻
發(fā)表文章
致 謝

【參考文獻】

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1 張曼，周愛儒;血管內(nèi)皮生長因子的功能與應用[J];生理科學進展;1996年03期

本文編號：2856038