第一部分 人胰島素原基因的定點(diǎn)突變和修飾 目的：完成人胰島素原基因5個(gè)堿基的定點(diǎn)突變，并加上信號(hào)肽和增強(qiáng)表達(dá)的Kozak序列，使之能在普通細(xì)胞中被Furin蛋白酶識(shí)別，從而去除C肽，分泌成熟胰島素。 方法：采用PCR體外定點(diǎn)突變技術(shù)（PCR-SDM），設(shè)計(jì)4對引物，引入5個(gè)Furin蛋白酶識(shí)別的突變位點(diǎn)，通過重疊延伸法PCR擴(kuò)增，使人胰島素原編碼基因B10密碼子由CAC突變?yōu)镚AC；C3密碼子由GAA突變?yōu)锳AA；C4密碼子由GCT突變?yōu)镃GT；C32密碼子由CTT突變?yōu)镃GT，并在其上游加上信號(hào)肽和Kozak序列，將擴(kuò)增片段克隆入T載體并測序。 結(jié)果：DNA測序結(jié)果表明預(yù)期位點(diǎn)突變符合要求，信號(hào)肽和Kozak序列正確引入。 結(jié)論：應(yīng)用PCR誘導(dǎo)突變技術(shù)，在體外能準(zhǔn)確、簡便有效誘導(dǎo) 國家自然科學(xué)基金資助(No.30070356) WP=10 胰島素原基因突變，使體外應(yīng)用非內(nèi)分泌細(xì)胞構(gòu)建高效分泌成熟胰島素細(xì)胞克隆成為可能。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

圖 1-1 pHIL-D2 的物理圖譜Figure1-1 Map of pHIL-D2Amp+）質(zhì)粒：是一種高效克隆 PCR 產(chǎn)物（TA Cloni 載體改建而成的，即在 pUC18 載體的多克隆位點(diǎn)之間插入了 EcoRⅤ識(shí)別位點(diǎn)，用 EcoRⅤ進(jìn)行酶切加“T”而成，它具有 pUC18 載體完全相同的功能酶反應(yīng)時(shí)都有在 PCR 產(chǎn)物的 3’末端添加一個(gè)“A可以大大提高 PCR 產(chǎn)物的連接、克隆效率（圖 1-2）

圖 1-2 pMD18-T 的物理圖譜Figure1-2 Map of pMD18-T菌種：oli DH5α及 E.coli JM109 菌株由第三軍醫(yī)大學(xué)野戰(zhàn)外科研究所分子生驗(yàn)室保存，楊登科博士惠贈(zèng)。主要儀器和器皿sTM and Milli-QTM 水純化系統(tǒng)（Millipore，美國）antiTM J-30I 型低溫超速離心機(jī)（BECKMAN，美國）Q-X100 恒溫振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司，中國)-7500 紫外分光光度計(jì)(BECKMAN，美國)

Figure1-3：PCR pattern for human proinsulin reconstruction圖 1-3：用于改造胰島素原的 PCR 模式圖（1）第一輪 PCR 反應(yīng)：以 PHIL-D2-hPINS 質(zhì)粒為模板，分別以 F02/R03，F(xiàn)03/R02，F(xiàn)04/R01 為引物進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系：10×Pyrobest Buffer 5 μl模板 DNA 1 μl上游引物 1 μl下游引物 1 μldNTP Mixture (2.5mM each) 4 μlPyrobest DNA Polymerase 1 μl
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本文編號(hào)：2851337