自噬和凋亡在病毒感染中起著關(guān)鍵作用,一方面可以通過(guò)降解病毒,遞呈病毒抗原,激活機(jī)體免疫反應(yīng),從而達(dá)到清除病毒的目的；另一方面,病毒也可利用對(duì)自噬和凋亡的調(diào)控逃逸機(jī)體的抗病毒作用,維持自身的存活和復(fù)制。病毒感染細(xì)胞后可以引起細(xì)胞死亡,但同時(shí)病毒又必須借助活的細(xì)胞完成自身的復(fù)制過(guò)程,而正常狀態(tài)下,自噬利于細(xì)胞存活,凋亡卻是細(xì)胞的死亡方式,因此自噬和凋亡之間的平衡對(duì)病毒的復(fù)制周期影響重大。研究表明,柯薩奇病毒3型(Coxsackie virus,CVB3)可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬,也可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。但目前,CVB3誘導(dǎo)自噬的具體發(fā)生機(jī)制不詳,凋亡發(fā)生的依賴途徑研究結(jié)果不一致；自噬和凋亡之間的相互調(diào)控機(jī)制、CVB3對(duì)自噬和凋亡關(guān)系的影響以及自噬的凋亡的關(guān)系對(duì)CVB3復(fù)制周期的影響目前也都不明確。因此,本文通過(guò)體外實(shí)驗(yàn),圍繞上述問(wèn)題展開研究,以深入了解CVB3與細(xì)胞間的直接相互作用。 在本試驗(yàn)中,我們首先證實(shí)了自噬體在CVB3感染過(guò)程中的表現(xiàn)及調(diào)控機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,CVB3感染HeLa細(xì)胞后,自噬體增多；而予巴洛弗霉素抑制自噬體和溶酶體的結(jié)合后,自噬體進(jìn)一步增多,說(shuō)明在CVB3感染過(guò)程中,自噬途徑仍能發(fā)揮降解功能,自噬體累積的原因在于自噬體的生成增多。為進(jìn)一步探求CVB3誘導(dǎo)自噬體生成增多的機(jī)制,我們檢測(cè)了細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated Protein kinases, ERK)的激活狀態(tài),即磷酸化-ERK(p-ERK)的表達(dá),結(jié)果顯示,p-ERK在CVB3感染后表達(dá)增多,說(shuō)明ERK蛋白被激活；而予U0126(有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)抑制劑)處理HeLa細(xì)胞后,ERK的激活水平及與自噬體數(shù)量均減少,說(shuō)明HeLa細(xì)胞感染CVB3后,ERK的激活與自噬體的增多有關(guān)。 接下來(lái),ERK激活的機(jī)制被進(jìn)一步探索。首先,我們檢測(cè)了AMPK/MEK/ERK通路的活性狀態(tài)：結(jié)果顯示,CVB3感染后AMP相關(guān)的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)、MAPK/ERK激酶(MAPK/ERK kinase,MEK)均被激活,并且磷酸化-AMPK(p-AMPK)和磷酸化-MEK(p-MEK)間的相互作用增強(qiáng),而以compoundC(AMPK激酶抑制劑)處理HeLa細(xì)胞后,MEK、ERK活性水平下降,提示ERK可以通過(guò)AMPK/MEK/ERK通路被激活：而通過(guò)進(jìn)一步的檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)CVB3感染的HeLa細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子濃度升高、三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate, ATP)含量及線粒體膜勢(shì)能降低,上述結(jié)果提示,AMPK/MEK/ERK通路的激活可能在于,CVB3感染造成細(xì)胞膜通透性增高,從而使細(xì)胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子濃度升高,損傷線粒體,ATP含量降低,激活A(yù)MPK蛋白,進(jìn)而激活整個(gè)通路;其次,我們檢測(cè)了另一條ERK的激活通路即Ras/Raf/MEK/ERK通路的活化狀態(tài)：結(jié)果顯示,CVB3感染后,磷酸化-Raf1(p-Raf)蛋白和磷酸化-MEK(p-MEK)蛋白表達(dá)均增加,說(shuō)明Ras、Raf1蛋白均被活化；進(jìn)一步檢測(cè)MEK是否可以通過(guò)該途徑被激活,結(jié)果顯示Raf1蛋白和p-MEK蛋白結(jié)合增加,而以GW5074(Raf激酶抑制劑)抑制Raf1蛋白的活性,MEK、ERK蛋白的激活也受到抑制,證實(shí)MEK、ERK蛋白也可以通過(guò)Ras/Raf/MEK/ERK通路被激活；為進(jìn)一步探索CVB3與Ras/Raf/MEK/ERK通路活化的關(guān)系,我們檢測(cè)了RasGAP蛋白的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),RasGAP蛋白于9h.p.i.被裂解,說(shuō)明CVB3感染后可能通過(guò)裂解RasGAP蛋白,使Ras蛋白被活化,進(jìn)而整個(gè)Ras/Raf/MEK/ERK通路被活化。 然而,雖然兩條通路在12h.p.i.后均仍處于較高的激活水平,但是,自噬體數(shù)量卻開始減少,因此,從CVB3感染后12h起,可能出現(xiàn)了抑制自噬體生成的因素。為驗(yàn)證該假設(shè),首先我們檢測(cè)了自噬相關(guān)蛋白(Autophagy-related gene,Atg)-5和beclin-1蛋白的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),二者在9h.p.i.均被裂解；而進(jìn)一步檢測(cè)多種含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, caspase),包括Capase3、8、9等,結(jié)果發(fā)現(xiàn),從CVB3感染9h起,這些Caspase蛋白均有不同程度的激活,與Atg5、beclin-1被裂解的時(shí)間點(diǎn)一致,因此,為進(jìn)一步探索Caspase蛋白的激活與Atg5、beclin1蛋白裂解間的關(guān)系,我們予多種Caspase抑制劑(Z-VAD-FMK、Z-LEHD-FMK、Z-IETD-FMK)抑制Caspase舌性后,Atg5、beclin-1蛋白的裂解條帶均明顯減少或消失,自噬水平明顯增高；同時(shí),抑制caspase后,凋亡水平明顯下降。這些結(jié)果提示,CVB3感染導(dǎo)致的凋亡依賴于caspase途徑,激活的caspase裂解了Atg5和beclin-1蛋白,從而抑制了自噬水平,卻促進(jìn)了凋亡的發(fā)生。 為了進(jìn)一步明確Caspase裂解自噬相關(guān)蛋白Atg5和beclin-1蛋白的原因,即凋亡的發(fā)生是否依賴于自噬的抑制,我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)觀察了自噬對(duì)凋亡的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),自噬對(duì)凋亡的作用較復(fù)雜。以自噬抑制劑(3-MA)或自噬誘導(dǎo)劑(雷帕霉素,Rapamycin)分別處理細(xì)胞后,常規(guī)感染CVB3,并于18h.p.i.收取細(xì)胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬體數(shù)量及凋亡水平均相應(yīng)的減少或增加；而予3-MA后,3h.p.i.收取的細(xì)胞凋亡水平降低,但予Rapamycin處理組,細(xì)胞的凋亡水平無(wú)明顯變化。18h.p.i時(shí)自噬和凋亡之間呈現(xiàn)正相關(guān)性變化,其原因可能在于不同的處理對(duì)病毒量的影響。為進(jìn)一步證實(shí)該假設(shè),CVB3按不同的MOI感染HeLa細(xì)胞,檢測(cè)凋亡水平及細(xì)胞內(nèi)CVB3mRNA的表達(dá),結(jié)果提示病毒量的變化可以直接引起凋亡水平的變化。而檢測(cè)感染后不同時(shí)間點(diǎn)HeLa細(xì)胞中CVB3含量的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),3h.p.i.病毒量較低,因此,病毒量本身的變化可能對(duì)凋亡的影響不大,此時(shí)干擾自噬體形成,可以了解自噬對(duì)凋亡的真正影響,即自噬抑制凋亡。 接下來(lái),本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步探索了自噬抑制凋亡的機(jī)制。我們分別予p62siRNA或p62質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞,使p62蛋白相對(duì)的減少或增加,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Caspase-8活性相應(yīng)增強(qiáng)或降低,但Caspase-3、9的活性變化與p62蛋白的變化并不一致。而予巴弗洛霉素處理細(xì)胞后,無(wú)論予p62siRNA或p62質(zhì)粒,Caspase3、8、9的活性均無(wú)明顯變化,因此,自噬抑制凋亡的機(jī)制在于p62蛋白介導(dǎo)的自噬途徑對(duì)活化的Caspase-8的降解。而檢測(cè)p62蛋白在感染后各時(shí)間點(diǎn)的變化,發(fā)現(xiàn)該蛋白在9h.p.i.表達(dá)減少,結(jié)合以往研究結(jié)果,我們認(rèn)為是CVB3直接造成了該蛋白的裂解,從而減少了自噬途徑對(duì)活化的Caspase-8的降解,促使細(xì)胞從自噬轉(zhuǎn)變?yōu)榈蛲�。然�?通過(guò)分析Atg5及beclin-1蛋白的檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),二者的蛋白總量均有所增高,而且mRNA水平在CVB3感染后也均有增高,因此自噬的發(fā)生存在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,從而避免細(xì)胞過(guò)早的發(fā)生凋亡。 自噬和凋亡間的復(fù)雜關(guān)系對(duì)CVB3生活周期的影響如何?本實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行了進(jìn)一步的驗(yàn)證。分別予自噬抑制劑(3-MA)、自噬誘導(dǎo)劑(Rapamycin)、凋亡擬制劑(Z-VAD-FMK、Z-LEHD-FMK、Z-IETD)處理細(xì)胞后,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)及上清中CVB3含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),予自噬抑制劑或誘導(dǎo)劑后,細(xì)胞內(nèi)及上清中的CVB3含量分別下降或上升；予凋亡抑制劑后,在低劑量時(shí),細(xì)胞內(nèi)CVB3mRNA的含量略升高,而上清中病毒含量下降；加大劑量后細(xì)胞內(nèi)及上清中病毒的含量進(jìn)一步減少。結(jié)合以往的研究,我們認(rèn)為自噬利于CVB3的復(fù)制而非釋放,而凋亡利于CVB3的釋放而非復(fù)制。 綜上所述,我們認(rèn)為CVB3可以通過(guò)各種機(jī)制影響被感染細(xì)胞的自噬和凋亡過(guò)程,并利用自噬向凋亡的轉(zhuǎn)換完成自身的復(fù)制,具體表現(xiàn)為：CVB3感染后,一方面,可以通過(guò)直接裂解RasGAP蛋白,從而激活Ras/Raf/MEK途徑；另一方面引起了胞膜通透性的改變,使細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子濃度增高,線粒體被損傷,ATP減少,從而激活A(yù)MPK/MEK途徑。上述兩條途徑的激活都可以導(dǎo)致ERK的活化,后者的活化可以導(dǎo)致自噬體累積。CVB3利用自噬體進(jìn)行復(fù)制。與此同時(shí),自噬體通過(guò)p62介導(dǎo)活化的Caspase-8的降解,從而抑制凋亡,保證CVB3有充足的時(shí)間進(jìn)行復(fù)制。到復(fù)制中后期,如感染后9h開始,CVB32A和3B蛋白組裝完成,可以裂解p62蛋白,解除自噬對(duì)活化的Caspase-8的降解,活化的Caspase-8逐漸積累,與Caspase-9途徑上的凋亡蛋白共同裂解自噬相關(guān)蛋白Atg5、beclin-1,抑制自噬體的產(chǎn)生,從而使活化的Caspase-8進(jìn)一步累積,自噬逐漸向凋亡轉(zhuǎn)換,但在此過(guò)程中Atg5及beclin-1存在mRNA水平的調(diào)控,控制凋亡發(fā)生的速度,從而使CVB3在充分復(fù)制后得以釋放。上述機(jī)制的闡明,有助于我們更好的了解CVB3的復(fù)制周期與細(xì)胞間的相互作用,從而為防治CVB3感染開拓思路。
【學(xué)位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2014
【中圖分類】：R363
【部分圖文】：

一.CVB3感染后自_；的表現(xiàn)及誘導(dǎo)機(jī)制1. CVB3感染后自趣體數(shù)量增多為觀察CVB3感染對(duì)自唾體數(shù)量的影響，我們釆用Western blot方法檢測(cè)了 CVB3感染的HeLa細(xì)胞中LC3蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示（圖1-1 A)，CVB3感染后3h，LC3II蛋白表達(dá)即幵始增多，9 h達(dá)到峰值后，從12h開始減少，24h時(shí)再次降低，說(shuō)明自唾體的數(shù)量先增多后減少；而LC3I蛋白從感染后6h開始減少，9 h達(dá)到最低值后，從12h開始增多，24h時(shí)進(jìn)一步增多，結(jié)果說(shuō)明自嗟體的生成先增多后減少。為進(jìn)一步證實(shí)在CVB3感染過(guò)程中確有自卩蜜體增多現(xiàn)象，我們用免疫焚光的方法再一次檢測(cè)了 LC3蛋白的表達(dá)，從圖1-1可以看出（其中綠色代表LC3蛋白，藍(lán)色代表細(xì)胞核），9h.p. LLC3熒光點(diǎn)明顯聚集成團(tuán)塊狀，而對(duì)照組呈散點(diǎn)狀分布，說(shuō)明在感染CVB3的細(xì)胞中確實(shí)有自暖體增多的現(xiàn)象；接下來(lái)，我們通過(guò)予巴洛弗霉素處理細(xì)胞以進(jìn)一步了解在CVB3感染過(guò)程中自噬體增多的原因，結(jié)果（圖1-1C)顯示，予巴洛弗霉素抑制自噬體和溶酶體的結(jié)合后，LC3II蛋白及自嚼途徑特異性降解蛋白p62蛋白表達(dá)均升高，該結(jié)果表明：自唾途徑的降解功能仍存在，因此，CVB3感染導(dǎo)致的自喫體增多的主要原因在于自哩體的生成增多。A.

圖1-1 A. CVB3以M01=10感染HeLa細(xì)胞，于感染后不同時(shí)間點(diǎn)收取細(xì)胞。Westblot法檢測(cè)LC3蛋白的表達(dá)；B. CVB3感染后9h, LC3蛋白的熒光檢測(cè)（綠色LC3蛋白，藍(lán)色代表細(xì)胞核，X100倍）；C.予bafilomycin lOOrai處理細(xì)胞IhCVB3按M01=10常規(guī)感染細(xì)胞，18h. p. i.收取細(xì)胞，Western blot法檢測(cè)LC3及蛋白。* P〈0.05組間相比。A組實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次；B和C組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。2自唾體的增多與ERK的激活有關(guān)為探索CVB3感染過(guò)程中自噬體增多的機(jī)制，首先，我們檢測(cè)了 ERK的活即憐酸化-ERK (P-ERK)的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，ERK總蛋白量各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯改變，而從6h.p. i.開始，ERK總蛋白中磷酸化狀態(tài)的E表達(dá)升高，12h、18 h維持在峰值，24h略有減少（圖1-2A),說(shuō)明從感染始ERK蛋白即被激活，并且一直處于較高水平的活性狀態(tài)。隨后，我們采激酶抑制劑U0126處理細(xì)胞以觀察ERK活性狀態(tài)對(duì)自唾的影響，結(jié)果顯示，蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯改變，但P-ERK蛋白表達(dá)明顯受抑制；LC3I蛋白增多，36

各時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯改變，而從6h.p. i.開始，ERK總蛋白中磷酸化狀態(tài)的ERK蛋白表達(dá)升高，12h、18 h維持在峰值，24h略有減少（圖1-2A),說(shuō)明從感染后6h幵始ERK蛋白即被激活，并且一直處于較高水平的活性狀態(tài)。隨后，我們采用MAPK激酶抑制劑U0126處理細(xì)胞以觀察ERK活性狀態(tài)對(duì)自唾的影響，結(jié)果顯示，ERK總蛋白的表達(dá)量無(wú)明顯改變，但P-ERK蛋白表達(dá)明顯受抑制；LC3I蛋白增多，而LC3n36

本文編號(hào)：2851357