自噬和凋亡在病毒感染中起著關(guān)鍵作用,一方面可以通過降解病毒,遞呈病毒抗原,激活機體免疫反應,從而達到清除病毒的目的；另一方面,病毒也可利用對自噬和凋亡的調(diào)控逃逸機體的抗病毒作用,維持自身的存活和復制。病毒感染細胞后可以引起細胞死亡,但同時病毒又必須借助活的細胞完成自身的復制過程,而正常狀態(tài)下,自噬利于細胞存活,凋亡卻是細胞的死亡方式,因此自噬和凋亡之間的平衡對病毒的復制周期影響重大。研究表明,柯薩奇病毒3型(Coxsackie virus,CVB3)可以誘導細胞發(fā)生自噬,也可以誘導細胞發(fā)生凋亡。但目前,CVB3誘導自噬的具體發(fā)生機制不詳,凋亡發(fā)生的依賴途徑研究結(jié)果不一致；自噬和凋亡之間的相互調(diào)控機制、CVB3對自噬和凋亡關(guān)系的影響以及自噬的凋亡的關(guān)系對CVB3復制周期的影響目前也都不明確。因此,本文通過體外實驗,圍繞上述問題展開研究,以深入了解CVB3與細胞間的直接相互作用。 在本試驗中,我們首先證實了自噬體在CVB3感染過程中的表現(xiàn)及調(diào)控機制。實驗結(jié)果提示,CVB3感染HeLa細胞后,自噬體增多；而予巴洛弗霉素抑制自噬體和溶酶體的結(jié)合后,自噬體進一步增多,說明在CVB3感染過程中,自噬途徑仍能發(fā)揮降解功能,自噬體累積的原因在于自噬體的生成增多。為進一步探求CVB3誘導自噬體生成增多的機制,我們檢測了細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated Protein kinases, ERK)的激活狀態(tài),即磷酸化-ERK(p-ERK)的表達,結(jié)果顯示,p-ERK在CVB3感染后表達增多,說明ERK蛋白被激活；而予U0126(有絲分裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)抑制劑)處理HeLa細胞后,ERK的激活水平及與自噬體數(shù)量均減少,說明HeLa細胞感染CVB3后,ERK的激活與自噬體的增多有關(guān)。 接下來,ERK激活的機制被進一步探索。首先,我們檢測了AMPK/MEK/ERK通路的活性狀態(tài)：結(jié)果顯示,CVB3感染后AMP相關(guān)的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase, AMPK)、MAPK/ERK激酶(MAPK/ERK kinase,MEK)均被激活,并且磷酸化-AMPK(p-AMPK)和磷酸化-MEK(p-MEK)間的相互作用增強,而以compoundC(AMPK激酶抑制劑)處理HeLa細胞后,MEK、ERK活性水平下降,提示ERK可以通過AMPK/MEK/ERK通路被激活：而通過進一步的檢測,我們發(fā)現(xiàn)CVB3感染的HeLa細胞胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子濃度升高、三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate, ATP)含量及線粒體膜勢能降低,上述結(jié)果提示,AMPK/MEK/ERK通路的激活可能在于,CVB3感染造成細胞膜通透性增高,從而使細胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子濃度升高,損傷線粒體,ATP含量降低,激活AMPK蛋白,進而激活整個通路;其次,我們檢測了另一條ERK的激活通路即Ras/Raf/MEK/ERK通路的活化狀態(tài)：結(jié)果顯示,CVB3感染后,磷酸化-Raf1(p-Raf)蛋白和磷酸化-MEK(p-MEK)蛋白表達均增加,說明Ras、Raf1蛋白均被活化；進一步檢測MEK是否可以通過該途徑被激活,結(jié)果顯示Raf1蛋白和p-MEK蛋白結(jié)合增加,而以GW5074(Raf激酶抑制劑)抑制Raf1蛋白的活性,MEK、ERK蛋白的激活也受到抑制,證實MEK、ERK蛋白也可以通過Ras/Raf/MEK/ERK通路被激活；為進一步探索CVB3與Ras/Raf/MEK/ERK通路活化的關(guān)系,我們檢測了RasGAP蛋白的表達,結(jié)果發(fā)現(xiàn),RasGAP蛋白于9h.p.i.被裂解,說明CVB3感染后可能通過裂解RasGAP蛋白,使Ras蛋白被活化,進而整個Ras/Raf/MEK/ERK通路被活化。 然而,雖然兩條通路在12h.p.i.后均仍處于較高的激活水平,但是,自噬體數(shù)量卻開始減少,因此,從CVB3感染后12h起,可能出現(xiàn)了抑制自噬體生成的因素。為驗證該假設,首先我們檢測了自噬相關(guān)蛋白(Autophagy-related gene,Atg)-5和beclin-1蛋白的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),二者在9h.p.i.均被裂解；而進一步檢測多種含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase, caspase),包括Capase3、8、9等,結(jié)果發(fā)現(xiàn),從CVB3感染9h起,這些Caspase蛋白均有不同程度的激活,與Atg5、beclin-1被裂解的時間點一致,因此,為進一步探索Caspase蛋白的激活與Atg5、beclin1蛋白裂解間的關(guān)系,我們予多種Caspase抑制劑(Z-VAD-FMK、Z-LEHD-FMK、Z-IETD-FMK)抑制Caspase舌性后,Atg5、beclin-1蛋白的裂解條帶均明顯減少或消失,自噬水平明顯增高；同時,抑制caspase后,凋亡水平明顯下降。這些結(jié)果提示,CVB3感染導致的凋亡依賴于caspase途徑,激活的caspase裂解了Atg5和beclin-1蛋白,從而抑制了自噬水平,卻促進了凋亡的發(fā)生。 為了進一步明確Caspase裂解自噬相關(guān)蛋白Atg5和beclin-1蛋白的原因,即凋亡的發(fā)生是否依賴于自噬的抑制,我們通過實驗觀察了自噬對凋亡的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn),自噬對凋亡的作用較復雜。以自噬抑制劑(3-MA)或自噬誘導劑(雷帕霉素,Rapamycin)分別處理細胞后,常規(guī)感染CVB3,并于18h.p.i.收取細胞,結(jié)果發(fā)現(xiàn)自噬體數(shù)量及凋亡水平均相應的減少或增加；而予3-MA后,3h.p.i.收取的細胞凋亡水平降低,但予Rapamycin處理組,細胞的凋亡水平無明顯變化。18h.p.i時自噬和凋亡之間呈現(xiàn)正相關(guān)性變化,其原因可能在于不同的處理對病毒量的影響。為進一步證實該假設,CVB3按不同的MOI感染HeLa細胞,檢測凋亡水平及細胞內(nèi)CVB3mRNA的表達,結(jié)果提示病毒量的變化可以直接引起凋亡水平的變化。而檢測感染后不同時間點HeLa細胞中CVB3含量的變化,結(jié)果發(fā)現(xiàn),3h.p.i.病毒量較低,因此,病毒量本身的變化可能對凋亡的影響不大,此時干擾自噬體形成,可以了解自噬對凋亡的真正影響,即自噬抑制凋亡。 接下來,本實驗中進一步探索了自噬抑制凋亡的機制。我們分別予p62siRNA或p62質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞,使p62蛋白相對的減少或增加,結(jié)果發(fā)現(xiàn),Caspase-8活性相應增強或降低,但Caspase-3、9的活性變化與p62蛋白的變化并不一致。而予巴弗洛霉素處理細胞后,無論予p62siRNA或p62質(zhì)粒,Caspase3、8、9的活性均無明顯變化,因此,自噬抑制凋亡的機制在于p62蛋白介導的自噬途徑對活化的Caspase-8的降解。而檢測p62蛋白在感染后各時間點的變化,發(fā)現(xiàn)該蛋白在9h.p.i.表達減少,結(jié)合以往研究結(jié)果,我們認為是CVB3直接造成了該蛋白的裂解,從而減少了自噬途徑對活化的Caspase-8的降解,促使細胞從自噬轉(zhuǎn)變?yōu)榈蛲�。然�?通過分析Atg5及beclin-1蛋白的檢測,結(jié)果發(fā)現(xiàn),二者的蛋白總量均有所增高,而且mRNA水平在CVB3感染后也均有增高,因此自噬的發(fā)生存在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控,從而避免細胞過早的發(fā)生凋亡。 自噬和凋亡間的復雜關(guān)系對CVB3生活周期的影響如何?本實驗中進行了進一步的驗證。分別予自噬抑制劑(3-MA)、自噬誘導劑(Rapamycin)、凋亡擬制劑(Z-VAD-FMK、Z-LEHD-FMK、Z-IETD)處理細胞后,檢測細胞內(nèi)及上清中CVB3含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn),予自噬抑制劑或誘導劑后,細胞內(nèi)及上清中的CVB3含量分別下降或上升；予凋亡抑制劑后,在低劑量時,細胞內(nèi)CVB3mRNA的含量略升高,而上清中病毒含量下降；加大劑量后細胞內(nèi)及上清中病毒的含量進一步減少。結(jié)合以往的研究,我們認為自噬利于CVB3的復制而非釋放,而凋亡利于CVB3的釋放而非復制。 綜上所述,我們認為CVB3可以通過各種機制影響被感染細胞的自噬和凋亡過程,并利用自噬向凋亡的轉(zhuǎn)換完成自身的復制,具體表現(xiàn)為：CVB3感染后,一方面,可以通過直接裂解RasGAP蛋白,從而激活Ras/Raf/MEK途徑；另一方面引起了胞膜通透性的改變,使細胞胞質(zhì)內(nèi)游離鈣離子濃度增高,線粒體被損傷,ATP減少,從而激活AMPK/MEK途徑。上述兩條途徑的激活都可以導致ERK的活化,后者的活化可以導致自噬體累積。CVB3利用自噬體進行復制。與此同時,自噬體通過p62介導活化的Caspase-8的降解,從而抑制凋亡,保證CVB3有充足的時間進行復制。到復制中后期,如感染后9h開始,CVB32A和3B蛋白組裝完成,可以裂解p62蛋白,解除自噬對活化的Caspase-8的降解,活化的Caspase-8逐漸積累,與Caspase-9途徑上的凋亡蛋白共同裂解自噬相關(guān)蛋白Atg5、beclin-1,抑制自噬體的產(chǎn)生,從而使活化的Caspase-8進一步累積,自噬逐漸向凋亡轉(zhuǎn)換,但在此過程中Atg5及beclin-1存在mRNA水平的調(diào)控,控制凋亡發(fā)生的速度,從而使CVB3在充分復制后得以釋放。上述機制的闡明,有助于我們更好的了解CVB3的復制周期與細胞間的相互作用,從而為防治CVB3感染開拓思路。
【學位單位】：北京協(xié)和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2014
【中圖分類】：R363
【部分圖文】：

一.CVB3感染后自_；的表現(xiàn)及誘導機制1. CVB3感染后自趣體數(shù)量增多為觀察CVB3感染對自唾體數(shù)量的影響，我們釆用Western blot方法檢測了 CVB3感染的HeLa細胞中LC3蛋白的表達，結(jié)果顯示（圖1-1 A)，CVB3感染后3h，LC3II蛋白表達即幵始增多，9 h達到峰值后，從12h開始減少，24h時再次降低，說明自唾體的數(shù)量先增多后減少；而LC3I蛋白從感染后6h開始減少，9 h達到最低值后，從12h開始增多，24h時進一步增多，結(jié)果說明自嗟體的生成先增多后減少。為進一步證實在CVB3感染過程中確有自卩蜜體增多現(xiàn)象，我們用免疫焚光的方法再一次檢測了 LC3蛋白的表達，從圖1-1可以看出（其中綠色代表LC3蛋白，藍色代表細胞核），9h.p. LLC3熒光點明顯聚集成團塊狀，而對照組呈散點狀分布，說明在感染CVB3的細胞中確實有自暖體增多的現(xiàn)象；接下來，我們通過予巴洛弗霉素處理細胞以進一步了解在CVB3感染過程中自噬體增多的原因，結(jié)果（圖1-1C)顯示，予巴洛弗霉素抑制自噬體和溶酶體的結(jié)合后，LC3II蛋白及自嚼途徑特異性降解蛋白p62蛋白表達均升高，該結(jié)果表明：自唾途徑的降解功能仍存在，因此，CVB3感染導致的自喫體增多的主要原因在于自哩體的生成增多。A.

圖1-1 A. CVB3以M01=10感染HeLa細胞，于感染后不同時間點收取細胞。Westblot法檢測LC3蛋白的表達；B. CVB3感染后9h, LC3蛋白的熒光檢測（綠色LC3蛋白，藍色代表細胞核，X100倍）；C.予bafilomycin lOOrai處理細胞IhCVB3按M01=10常規(guī)感染細胞，18h. p. i.收取細胞，Western blot法檢測LC3及蛋白。* P〈0.05組間相比。A組實驗重復6次；B和C組實驗至少重復3次。2自唾體的增多與ERK的激活有關(guān)為探索CVB3感染過程中自噬體增多的機制，首先，我們檢測了 ERK的活即憐酸化-ERK (P-ERK)的表達。Western blot結(jié)果顯示，ERK總蛋白量各時間點均無明顯改變，而從6h.p. i.開始，ERK總蛋白中磷酸化狀態(tài)的E表達升高，12h、18 h維持在峰值，24h略有減少（圖1-2A),說明從感染始ERK蛋白即被激活，并且一直處于較高水平的活性狀態(tài)。隨后，我們采激酶抑制劑U0126處理細胞以觀察ERK活性狀態(tài)對自唾的影響，結(jié)果顯示，蛋白的表達量無明顯改變，但P-ERK蛋白表達明顯受抑制；LC3I蛋白增多，36

各時間點均無明顯改變，而從6h.p. i.開始，ERK總蛋白中磷酸化狀態(tài)的ERK蛋白表達升高，12h、18 h維持在峰值，24h略有減少（圖1-2A),說明從感染后6h幵始ERK蛋白即被激活，并且一直處于較高水平的活性狀態(tài)。隨后，我們采用MAPK激酶抑制劑U0126處理細胞以觀察ERK活性狀態(tài)對自唾的影響，結(jié)果顯示，ERK總蛋白的表達量無明顯改變，但P-ERK蛋白表達明顯受抑制；LC3I蛋白增多，而LC3n36

本文編號：2851357