登革熱(Dengue fever，DF)／登革出血熱(Dengue haemorrhagic fever，DHF)是重要的蟲媒病毒病之一，其病原體登革病毒為黃病毒屬(Flavivirus)具包膜的單股正鏈RNA病毒，主要由埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白紋伊蚊(Ae．albopictus)傳播，廣泛流行于全球熱帶和亞熱帶地區(qū)。諸多的實驗室和野外實驗均已證實在自然界存在著白紋伊蚊經卵傳遞登革病毒的現象，而滯育卵是白紋伊蚊實現遠距離擴散的主要途徑之一。登革病毒能否在感染白紋伊蚊滯育卵內存活，并隨著滯育卵通過交通運輸、舊輪胎貿易等人類活動擴散到世界許多國家和地區(qū)?是一個值得關注的問題，目前尚未見研究報道。 本研究以白紋伊蚊廣州株為研究對象，經口感染大劑量登革Ⅱ型病毒(Dengue 2 virus，DEN-2)后，收集3個生殖營養(yǎng)周環(huán)產的卵，一部分在實驗室條件下模擬冬季相對低溫、短光照及干燥的自然環(huán)境條件(4℃、75％RH、L／D=8／16)，誘導滯育；另一部分采用實驗室常規(guī)保存條件，在常溫條件下給以干燥處理(25℃、75％RH、L／D=14／10)。首先利用半套式PCR、C6／36細胞培養(yǎng)分離病毒等方法檢測和分離卵內病毒；進一步用核酸雜交的方法監(jiān)測卵內病毒RNA的合成，以期確證登革Ⅱ型病毒能否在白紋伊蚊滯育卵內存活并有可能增殖，探討滯育卵代謝活動的減弱與病毒轉錄、復制間的相互協(xié)調機制；并通過滯育卵解除滯育后F_1代蚊蟲感染率檢測，以及叮咬敏感乳鼠的傳播實驗，明確登革Ⅱ型病毒能否經滯育卵傳遞至子代并能進一步水平傳播；進而了解垂直傳遞病毒是否影響滯育卵的孵化及F_1代蚊蟲的生殖能力，來探討自然界蚊媒體內病毒的保存機制以及媒介—病毒—宿主三者之間的相互關系。本研究獲得以下幾個方面的結果： 1 感染白紋伊蚊滯育卵內病毒的檢測和分離 通過半套式PCR、C6／36細胞培養(yǎng)分離病毒等方法，多角度證實能在感染DEN-2白紋伊蚊滯育卵內檢測和分離到病毒，同時常規(guī)保存條件下干燥處理的卵內也檢測和分離到病毒。另外，研究發(fā)現接種C6／36細胞的感染白紋伊蚊常規(guī)干燥保存卵導致C6／36細胞病變的時間較滯育卵早12小時左右。 2 卵內登革病毒的存在狀態(tài) 利用地高辛標記的不對稱PCR擴增產物制備單鏈探針(正鏈和負鏈探針)，進行核酸雜交來監(jiān)測卵內登革病毒復制動態(tài)。Southern雜交方法在感染白紋伊蚊滯育卵和常規(guī)干燥保存的卵中均檢測到病毒正股RNA和負股RNA，但滯育卵中病毒負股RNA雜交信號非常的弱，表明負股RNA含量極低；常規(guī)干燥保存的卵內無論正股RNA還 of 是負股RNA，都有較強雜交信號。正股RNA和負股RNA的成功檢測，表明滯育卵 和常規(guī)干燥保存卵均感染病毒，即用S。＂them雜交的方法也能夠在感染白紋伊蚊滯育 卵和常規(guī)干燥保存的卵中均檢測到病毒；采用 L匯1沉淀的方法將復制中間型（RI） RN A和復制型（RF）RN A分開后，正鏈探針用于檢測復制中間型RN A，負鏈探針 用于確認復制型RNA的合成。斑點雜交結果發(fā)現常規(guī)干燥保存卵中，RI RNA和 RF RNA均有雜交信號，說明病毒仍然進行著循環(huán)復制；滯育卵中檢測不到RI RNA和 RF RNA的合成，而Southern雜交檢測到極少量的負股RNA，表明在滯育卵中病毒 復制的相對靜止發(fā)生在從負股 RNA到 RF RNA這一步。 3感染白紋伊蚊不同生殖營養(yǎng)周期F；代蚊蟲感染率差異 采用半套式PCR、C6八6細胞培養(yǎng)分離病毒等方法檢測FI代蚊蟲感染率，第一個 生殖營養(yǎng)周期滯育卵和常規(guī)干燥保存卵內均沒有檢測和分離到病毒，這與病毒在經口 感染的蚊蟲體內增殖的時間有關；此外，對第二、三生殖營養(yǎng)周期產卵孵化的于代蚊 蟲感染率檢測結果經統(tǒng)計學檢驗，結果顯示第二、三生殖營養(yǎng)周期FI代蚊蟲感染率 沒有顯著性差異…＞0刀5人 旱感染白紋伊蚊卵的滯育與常規(guī)干燥保存對子代感染率的影響 采用半套式PCR、C6／36細胞培養(yǎng)分離病毒等方法檢測滯育卵和常規(guī)干燥保存卵 孵化的h代蚊蟲感染率，半套式PCR檢測結果表明常規(guī)干燥保存卵孵化的F；代蚊蟲 感染DEN－2的批陽性率為 18．8O，子代最低感染率為 1：160（0．63O），明顯高于滯 育卵孵化的 FI代蚊蟲感染率（批陽性率為 9石％，于代最低感染率為 1：294二 ＊．34％廠，／檢驗的統(tǒng)計結果顯示經滯育卵和常規(guī)干燥保存卵孵化的子代蚊蟲感染 率有顯著性差異（Xz－2．47，p＜0．05人結果表明登革＊型病毒能夠經感染白紋伊蚊滯 育卵和常規(guī)干燥保存卵傳遞至于代。 5感染白紋伊蚊滯育卵孵化的h代成蚊叮咬乳鼠水平傳播登革病毒 低氧水刺激感染白紋伊蚊滯育卵孵化后，羽化5天的F；代雌蚊刺叮1 日齡健康 乳鼠，傳播陽性率為 6．l％，結果表明登革＊型病毒能經滯育卵傳遞至子代并能通過 叮咬敏感宿主水平傳播。 6＄染病毒對白紋伊蚊滯育卵的孵化及FI代成蚊產卵量的影響 用低氧水刺激滯育卵解除滯育后，收集按時間順序孵化的7批幼蟲，半套式PCR 檢測其陽性率，發(fā)現最早孵化的一批幼蟲最低感染率為 1：15（6石7％），第二批孵化 的幼蟲最低感染率為 1：75（0．13％），而在此之后
【學位單位】：西南農業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2003
【中圖分類】：R38
【部分圖文】：

為病毒基因組RNA，對RNA酶敏感。子代基因組的正鏈RNA是通過RNA的RI和RFRNA的形式合成的，然后子代RNA又呈現mRNA的作用，從而產生更多的病毒蛋白，同時又作為模板，產生更多的中間體，形成子代RNA(圖1.1)(殷震，劉景華，1997)。登革病毒的裝配過程涉及到病毒各結構成分之間極其復雜的分子間的相互作用。DEN病毒的核衣殼由衣殼蛋白C及基因組RNA構成，其中C蛋白含大量的Lys和Arg殘基，這些堿性氨基酸可部分中和RNA的負電荷。目前病毒衣殼蛋白如何與子代RNA形成病毒核衣殼，以及對C蛋白具有的核定位位點重要性極其與病毒形態(tài)發(fā)生的關系尚不清楚。初步認為登革病毒顆粒組裝過程如下:在蛋白合成過程中E、PrM插入粗面內質網膜;C蛋白與病毒的RNA在胞漿中裝配成核衣殼，并集中于內質網膜的細胞漿側。核衣殼可能通過芽生方式獲得包膜，非成熟病毒顆粒在內質網組裝，然后進一步轉運到反式高爾基體

低溫、短光照誘導的滯育時間為4周、6周的感染白紋伊蚊滯育卵及常規(guī)干燥保存6周的卵，應用黃病毒通用引物進行Rl飛PCR擴增后，以該擴增產物為模板，應用內引物的酶促擴增可得到與設計相符的189bp的目的基因片段(圖3.2)。實驗同時設置感染登革n型病毒C6/36細胞作為陽性對照，也擴增出189bP的目的片段，而非感染白紋伊蚊滯育卵和常規(guī)干燥保存的卵(陰性對照)采用該引物檢測無特異性擴增條帶出現。結果表明感染DEN一2病毒的白紋伊蚊滯育卵和常規(guī)干燥保存的卵中均能檢測到病毒。65432IM2000bP1000bP750bP500bP250bP100bP圖3.2感染OEN一2白紋伊蚊卵半套式PCR擴增產物M:DL2000DNAMarker(TaKaRa公司);l:感染oEN一2病毒的C6/36細胞;2:白紋伊蚊常規(guī)干燥保存卵;3:白紋伊蚊滯育4周的卵;4:白紋伊蚊滯育6周的卵;5:非感染常規(guī)干燥保存卵;6:非感染滯育卵

M:oLZ000洲^Marker(T妞KaRa公司)，1:DEN一2infeCtedc6/36cell，2:Normalpreservedofeggs，3:4一weeksdiaPausingeggs，4:6一weeksdiaPausingeggs，5:UninfeetednormalPreservedeggs，:UninfeeteddiaPausingeggs3.2.3C6136細胞培養(yǎng)分離病毒分別接種滯育卵和常規(guī)干燥保存卵研磨液的C6/36細胞，盲傳一代后，細胞均出現典型病變(cytopathiceffect，CPE)，其中圖3.3一A為接種感染白紋伊蚊滯育卵后發(fā)生病變的細胞;圖3.4一A為接種感染白紋伊蚊常規(guī)干燥保存卵后發(fā)生病變的細胞�？梢钥闯霾《靖腥镜募毎螒B(tài)發(fā)生變化，細胞出現堆集甚至融合、破潰等現象。同時研究發(fā)現接種常規(guī)干燥保存卵的C6/36細胞出現病變的時間較滯育卵早12小時左右，這可能與標本中病毒數量的多少或與病毒生長的速率有關(殷震，1997)，或者可能與病毒在這兩種不同處理卵中存在狀態(tài)有關。上述結果表明感染白紋伊蚊滯育卵和常規(guī)干燥保存的卵中均能夠分離到病毒，該結果與半套式PCR檢測結果一致，即在感染白紋伊蚊滯育卵和常規(guī)干燥保存的卵中均能夠檢測和分離到病毒。
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本文編號：2848443