腫瘤是威脅人類健康的世界性課題。目前惡性腫瘤的治療,仍然是以手術(shù)為主并輔以放、化療,盡管如此,仍有相當(dāng)一部分病人最終死于腫瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。干細(xì)胞是指能夠分化成為多種成熟細(xì)胞的特殊細(xì)胞,是胚胎發(fā)育、器官形成的基礎(chǔ)。腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為,腫瘤發(fā)生源于基因突變的多能干細(xì)胞,這類細(xì)胞具有永久自我更新和分化能力,正是由于這類細(xì)胞的存在,腫瘤才能不斷生長(zhǎng)。目前放療和化療主要針對(duì)腫瘤中已分化的細(xì)胞亞群,并不針對(duì)腫瘤干細(xì)胞,但正是這類所占比例很低的腫瘤干細(xì)胞決定了惡性腫瘤的生物學(xué)特性。 迄今為止,研究者在多種腫瘤組織中分離出具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞,這類細(xì)胞能夠在免疫抑制動(dòng)物中復(fù)制出與原發(fā)腫瘤生物學(xué)特性一樣的腫瘤組織。普通腫瘤免疫治療應(yīng)用的抗原大多是表達(dá)在已分化腫瘤細(xì)胞上,但腫瘤干細(xì)胞本身并不一定表達(dá)這類抗原,因此加載普通抗原的樹(shù)突細(xì)胞疫苗對(duì)腫瘤干細(xì)胞沒(méi)有很好的靶向性。利用特異性腫瘤干細(xì)胞抗原研制新型樹(shù)突細(xì)胞疫苗,將有望彌補(bǔ)現(xiàn)在腫瘤治療方法的不足。目前分離腫瘤干細(xì)胞主要依靠其特異性分子標(biāo)記物,乙醛脫氫酶(ALDH)作為腫瘤干細(xì)胞特異性標(biāo)記物已有比較深入的研究[1]。 本研究中,我們利用ALDH作為流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞的標(biāo)記物,從Hepal-6肝癌細(xì)胞株和B16黑色素瘤細(xì)胞株中分選出ALDH+細(xì)胞作為腫瘤干細(xì)胞,并驗(yàn)證其具有腫瘤干細(xì)胞特性,然后制備荷載腫瘤干細(xì)胞抗原的樹(shù)突細(xì)胞疫苗,利用小鼠肝癌原位模型和肺轉(zhuǎn)移模型,通過(guò)流式細(xì)胞儀和小動(dòng)物活體成像技術(shù)研究上述疫苗對(duì)小鼠腫瘤免疫功能的影響,以及其中可能的免疫機(jī)制,為以后進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用做鋪墊。 第一部分制備腫瘤干細(xì)胞抗原 目的：從Hepal-6肝癌細(xì)胞株和B16黑色素瘤細(xì)胞株中分選出ALDH+細(xì)胞,驗(yàn)證其具有腫瘤干細(xì)胞特性,以此制備腫瘤干細(xì)胞抗原。 方法：使用流式細(xì)胞儀,利用ALDEFLUOR干細(xì)胞鑒定試劑盒,從Hepal-6肝癌細(xì)胞株和B16黑色素瘤細(xì)胞株中分選出相應(yīng)的ALDH+細(xì)胞和ALDH細(xì)胞；通過(guò)腫瘤細(xì)胞克隆球形成實(shí)驗(yàn)和皮下成瘤實(shí)驗(yàn),驗(yàn)證分選出的ALDH+細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性；接著使用反復(fù)凍融法,分別制備腫瘤干細(xì)胞抗原,以及ALDH-細(xì)胞和普通腫瘤細(xì)胞抗原。 結(jié)果：Hepal一6細(xì)胞和B16細(xì)胞流式細(xì)胞分選圖顯示：Hepal-6ALDH所占比例為3.27%,ALDH所占比例為4.09%；B16ALDH'所占比例為3.40%,ALDH所占比例為15.11%。在無(wú)血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)10d后,高倍鏡視野下(400倍)觀察克隆球形成情況：ALDH'細(xì)胞形成眾多細(xì)胞克隆球,而未經(jīng)分選的普通腫瘤細(xì)胞和ALDH細(xì)胞則幾乎沒(méi)有細(xì)胞克隆球形成,Hepal-6細(xì)胞株與B16細(xì)胞株所得結(jié)果一致。以不同數(shù)量腫瘤細(xì)胞接種小鼠皮下瘤實(shí)驗(yàn)：接種50000、2000、500個(gè)Hepal-6ALDH細(xì)胞4周后均明顯成瘤,而接種未經(jīng)分選的普通腫瘤細(xì)胞和Hepal-6ALDH細(xì)胞4周后均沒(méi)有成瘤,B16細(xì)胞系實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Heoal-6細(xì)胞系的一致。 結(jié)論：獲得并證明Hepal-6ALDH'細(xì)胞和B16ALDH細(xì)胞具有腫瘤干細(xì)胞特性,經(jīng)反復(fù)凍融后,獲得相應(yīng)腫瘤干細(xì)胞抗原。 第二部分體外荷載腫瘤干細(xì)胞抗原的樹(shù)突細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞功能的影響 目的：研究體外荷載腫瘤干細(xì)胞抗原的樹(shù)突細(xì)胞對(duì)免疫細(xì)胞功能的影響。 方法：體外加載抗原分為四組：A.PBS對(duì)照組；B.加載未經(jīng)分選的普通腫瘤細(xì)胞裂解物抗原組；C.加載ALDH腫瘤細(xì)胞裂解物抗原組；D.加載ALDH腫瘤細(xì)胞裂解物抗原組；與小鼠DC細(xì)胞體外共培養(yǎng),測(cè)上清中的IL-12含量；然后將荷載不同抗原的DC與脾細(xì)胞(主要以T細(xì)胞為主)體外共培養(yǎng),進(jìn)行細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn),靶細(xì)胞分別為普通腫瘤細(xì)胞和ALDH'腫瘤細(xì)胞(腫瘤干細(xì)胞)。 結(jié)果：Hepal-6細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中A.PBS對(duì)照組；B.加載未經(jīng)分選的Hepal-6普通腫瘤細(xì)胞裂解物抗原組；C.加載Hepal-6ALDH腫瘤細(xì)胞裂解物抗原組；D.加載Hepal-6ALDH腫瘤細(xì)胞裂解物抗原組,所得IL-12p70含量分別為54.45±3.976pg/ml,84.82±5.320pg/ml,83.38±5.889pg/ml,83.68±4.507pg/ml,B. C.D三組與PBS對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但B、C、D三組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；B16細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中四組IL-12p70含量分別為54.53±3.705pg/ml,84.12±5.156pg/ml,80.47±4.328pg/ml,85.43±5.260pg/ml,結(jié)果提示：B、C、D三組與PBS對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),但B、C、D三組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)中仍然分為四組：A.PBS對(duì)照組；B.加載未經(jīng)分選的普通腫瘤細(xì)胞抗原組；C.加載ALDH腫瘤細(xì)胞抗原組；D.加載ALDH腫瘤細(xì)胞抗原組。當(dāng)靶細(xì)胞為未分選的普通Hepal一6細(xì)胞和B16細(xì)胞時(shí),E：T值達(dá)到20：1,40：1,B組殺傷率優(yōu)于另外三組(P0.05),C、D兩組之間殺傷率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別,但優(yōu)于陰性對(duì)照組(P0.05)(靶細(xì)胞為未經(jīng)分選的普通Hepa1-6細(xì)胞和B16細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致)；當(dāng)靶細(xì)胞為Hepal-6ALDH+細(xì)胞和B16ALDH+細(xì)胞時(shí),E：T值達(dá)到10：1,20：1,40：1,D組殺傷率明顯優(yōu)于另外三組(P0.05)；B組殺傷率優(yōu)于A組和C組(P0.05),A、C兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別(靶細(xì)胞為Hepal-6ALDH+細(xì)胞和B16ALDH+細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)論一致)。 結(jié)論：不論以何種腫瘤細(xì)胞裂解物作為抗原,均可以使DC分泌更多的IL-12；不同腫瘤抗原,均增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)普通腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用；腫瘤干細(xì)胞抗原對(duì)腫瘤干細(xì)胞有很好的靶向作用。 第三部分用于活體成像的小鼠Hepal-6肝原位腫瘤模型和B16肺轉(zhuǎn)移腫瘤模型的建立 目的：建立動(dòng)物模型,為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)做鋪墊 方法：利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法,建立用于活體成像的Hepal-6luc細(xì)胞和B16luc細(xì)胞,體外觀測(cè)兩株細(xì)胞熒光表達(dá)情況；利用小鼠皮下瘤組織塊,建立Hepal-6luc肝原位腫瘤模型；利用小鼠尾靜脈注射,建立B16luc肺轉(zhuǎn)移模型；兩種腫瘤模型均使用小動(dòng)物活體成像技術(shù),觀測(cè)腫瘤熒光表達(dá)情況,并進(jìn)行進(jìn)一步解剖離體觀察,驗(yàn)證動(dòng)物模型建立成功。 結(jié)果：體外熒光實(shí)驗(yàn)中,細(xì)胞數(shù)達(dá)到104個(gè)時(shí)就會(huì)觀察到熒光。Hepal-6luc肝原位腫瘤模型和B161uc肺轉(zhuǎn)移模型活體成像情況良好,解剖后也證實(shí)動(dòng)物模型準(zhǔn)確可靠。 結(jié)論：建立可用于活體成像的小鼠Hepal-6肝原位腫瘤模型和B16肺轉(zhuǎn)移模型,為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供技術(shù)支持。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R730.5;R-332
【部分圖文】：

圖1-1.流式細(xì)胞分選圖如圖1-1所示，a和b分別為分選Hepal-6細(xì)胞DEAB和ALDFT流式細(xì)胞圖，結(jié)果顯示：所分選出的Hepal-eALDFT的細(xì)胞約占總體的3. 27%, Hepal-6 ALDH細(xì)胞占總體的4. 09%; C和d分別為分選B16細(xì)胞DEAB和ALDH+流式細(xì)胞圖，結(jié)

圖2-1. DC細(xì)胞分泌IL-12的情況如圖2-1: a圖所示DC細(xì)胞與以下抗原共培養(yǎng)A.PBS對(duì)照組；B.加載未經(jīng)分選的H印al-6普通腫瘤細(xì)胞裂解物抗原組；C.加載H印al-6 ALDH—腫瘤細(xì)胞裂解物抗原組；D.加載H印al-6ALDH+腫瘤細(xì)胞裂解物抗原組，所測(cè)得IL-12p70
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