研究背景： 心肌細(xì)胞在出生后就不能再生，對有絲分裂信號的反應(yīng)是細(xì)胞肥大而不是增生。心肌細(xì)胞的喪失會導(dǎo)致所在區(qū)域心肌收縮功能減退，以致心力衰竭，壞死心肌終而被成纖維細(xì)胞形成的疤痕組織所取代。近年來，采用自體細(xì)胞和生長因子修復(fù)組織的再生醫(yī)學(xué)迅猛發(fā)展。有人將培養(yǎng)的心肌細(xì)胞移植到損傷區(qū)心肌內(nèi)能夠明顯改善心功能，并稱之為“細(xì)胞心肌成形術(shù)”(cellular cardiomyoplasty)，有可能成為治療心力衰竭的有效手段。許多作者對胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)成心肌細(xì)胞進(jìn)行了大量研究，并取得了顯著進(jìn)展。但是，胚胎干細(xì)胞移植仍然存在許多問題，諸如免疫排斥，倫理道德問題等。繼胚胎干細(xì)胞后，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)受到了高度重視。來源于中胚層的MSC，是多能干細(xì)胞，在誘導(dǎo)后可以定向分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、成肌細(xì)胞以及肌腱細(xì)胞等多種細(xì)胞。MSC與心肌細(xì)胞同屬于中胚層。近期已經(jīng)有人應(yīng)用5-氮雜胞苷(5-Aza)成功地將體外培養(yǎng)的MSC誘導(dǎo)成為心肌樣細(xì)胞。Tomita等將人骨髓MSC植入免疫缺陷鼠心肌后，發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞可分化成為心肌細(xì)胞，且表達(dá)心肌細(xì)胞特有的desmin,α-actin，β-MHC2。有作者將骨髓MSC注射入心梗邊緣部位心肌內(nèi)，這些移植的MSC分化成為心肌細(xì)胞，且受損的心功能得到明顯改善。進(jìn)一步研究表明，MSC經(jīng)5-Aza誘導(dǎo)后分化為心肌樣細(xì)胞再行移植受損心肌部位，療效明顯優(yōu)于未誘導(dǎo)組。目前對于骨髓MSC定向分化為心肌樣細(xì)胞的研究處于起步階段，心肌樣細(xì)胞定向分化率仍然不高，對于心肌分化的調(diào)控機(jī)制研究甚少。因此，深入研究MSC分化過程中的調(diào)控機(jī)制對于尋求控制干細(xì)胞分化方向的手段，從而提高M(jìn)SC向心肌樣細(xì)胞定向分化率，促進(jìn)細(xì)胞心肌成形術(shù)的應(yīng)用有重要意義。 PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptorγ)作為核激素受體超家簇中的成員，是細(xì)胞分化重要的調(diào)控因子。通過調(diào)節(jié)其他轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)MSC分化，并在誘導(dǎo)MSC分化不同特異性表型之間起到開關(guān)作用。PPARγ在MSC向心肌樣細(xì)胞分化過程中的作用如何，目前尚無相關(guān)報道。 資料顯示，Nkx 2.5、GATA4、MEF-2C等基因是調(diào)控心肌細(xì)胞分化開始階段的重 第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 要轉(zhuǎn)錄因子。本文應(yīng)用培養(yǎng)小鼠MSC為研究材料，以5一Aza作為誘導(dǎo)劑，叫睬美辛 作為PPARY的配體，利用表達(dá)載體pEGFP一1一PPA助2轉(zhuǎn)染MsC，檢測PPA助對細(xì) 胞分化及其對轉(zhuǎn)錄因子MEF一ZC、Nkx2.5、GATA4 mRNA表達(dá)的影響，旨在探討PPA助 對MSC分化為心肌樣細(xì)胞的影響及其在分化過程中的調(diào)控作用。 方法與結(jié)果: 第一部分:探討了小鼠MSC的體外分離、純化、擴(kuò)增、多向誘導(dǎo)和向心肌樣細(xì) 胞定向分化的誘導(dǎo)條件。首先采用密度為1.082留ml的Percou細(xì)胞分離液分離小鼠骨 髓細(xì)胞中的單個核細(xì)胞，所獲細(xì)胞應(yīng)用DME樹低糖培養(yǎng)基+l0%胎牛血清進(jìn)行培養(yǎng)， 通過及時、反復(fù)傳代對MSC進(jìn)行純化和擴(kuò)增。平均5一6d在細(xì)胞達(dá)到80%左右融合時 進(jìn)行傳代。采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。應(yīng)用不同的誘導(dǎo)方法對細(xì)胞進(jìn)行多向誘導(dǎo) 分化，使細(xì)胞向成骨細(xì)胞、成心肌樣細(xì)胞、成脂肪細(xì)胞三個不同的方向分化。誘導(dǎo)成 心肌樣細(xì)胞分化時選取了5一Aza3林mol/L、5林mol/L、10林mol/L三種不同濃度。應(yīng)用四 環(huán)素?zé)晒鈽?biāo)記檢測鈣結(jié)節(jié)，油紅O染色檢測脂滴，免疫組織化學(xué)檢測ThT表達(dá)。 結(jié)果:MSC細(xì)胞形態(tài)保持均一的短梭形。12一14d細(xì)胞長成單層。細(xì)胞生長曲線: 第1、Zd細(xì)胞數(shù)量無明顯增加，第3d開始細(xì)胞數(shù)量明顯增加，MSC在第7d達(dá)到最 高峰。第8d開始進(jìn)入平臺期。細(xì)胞周期結(jié)果顯示:MSC中GI期的細(xì)胞占91 .74%， S+GZ的細(xì)胞約占8.26%，表明只有少數(shù)細(xì)胞進(jìn)入了活躍增殖期。成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞 出現(xiàn)鈣結(jié)節(jié)。成脂誘導(dǎo)的細(xì)胞胞漿內(nèi)出現(xiàn)大量脂滴。成心肌樣細(xì)胞誘導(dǎo)中以5-Aza 3林mol幾濃度為最佳，誘導(dǎo)后l月，部分細(xì)胞TnT表達(dá)陽性。5一Aza以5林mol/L及 10娜ol/L濃度誘導(dǎo)后雖有肌管樣結(jié)構(gòu)出現(xiàn)，但TnT表達(dá)始終呈陰性。 第二部分:應(yīng)用叫噪美辛作為P隊(duì)RY的配體作用于MSC以激活PPA助。將細(xì)胞 分為4組:A組用5一Aza3林mol/L誘導(dǎo)細(xì)胞分化;B組分別采用叼}噪美辛10一、10一，mol/L 兩種不同濃度作用于MSC，觀察細(xì)胞生長情況，形態(tài)變化;C組聯(lián)用5一Aza鴻}噪美辛 作用于MsC;D組為對照組，不誘導(dǎo)。應(yīng)用油紅一O檢測脂滴，免疫組織化學(xué)檢測PPARY 表達(dá)情況。 結(jié)果:叫噪美辛在10一mol幾濃度時對細(xì)胞有明顯的毒性，而10一smol/L時細(xì)胞生 長良好。對照組及單用10一，mol幾叫睬美辛作用Msc時，PPA助表達(dá)均呈陰性。單用 叫垛美辛并不能誘導(dǎo)MSC分化。單用5一Aza3卜mol幾誘導(dǎo)后的第3d，部分細(xì)胞PPARY 表達(dá)陽性。聯(lián)用6一Aza/叫噪美辛誘導(dǎo)時發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)后第3d幾乎所有細(xì)胞PPA助表達(dá) 陽性，繼續(xù)培養(yǎng)后分化為脂肪細(xì)胞。 第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 第三部分:分題卜重組表達(dá)載體pCAG一PPARYZ及pEGFP一Nl。將前者中的 PPA助2目的片段構(gòu)建入后者中。采用5’端一粘性末端一3’端平端構(gòu)建策略對目的基因 進(jìn)行亞克隆，構(gòu)建成pEGFP一Nl一PPA助2表達(dá)載體。酶切鑒定與測序鑒定相結(jié)合。分 題2:經(jīng)鑒定正確的重組質(zhì)粒用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染入MSC，應(yīng)用吼;:并采用休克法進(jìn) 行篩選?
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

細(xì)胞即可完全融合，細(xì)胞排列仍有規(guī)則的方向性。細(xì)胞生長曲線(見圖1一l)，第1、Zd細(xì)胞數(shù)量無明顯增加，第3d開始細(xì)胞數(shù)量明顯增加，MSC在第7d達(dá)到最高峰。第8d開始進(jìn)入平臺期。二、MSC的成心肌誘導(dǎo)培養(yǎng)(見照片4、照片5)經(jīng)5一Aza誘導(dǎo)后，細(xì)胞生長速度明顯減緩，以10娜of幾濃度最為明顯，5林mol/L次1112廠廠1110卜.——--一一777ttt，8}—一一一一一一一一子=一一一一-—一一知知心}III曹曹6卜一一一一.一一-一子—一一一界界}///444卜.一—一子一一一一一一一一一一一一一222卜.一-一=尸乙—一一~一.一一000Les~習(xí)一一Lreeses匕es習(xí)eseseses習(xí)eseseseses‘esesesesLeseseses‘eseses曰曰1112345678999天天數(shù)數(shù)圖圖1一1MSCs生長曲線線FFFigl一1ThegrowtheurveofMSCsss之。誘導(dǎo)gd后

圖3-1pEGFP一l表達(dá)載體及其多克隆位點(diǎn)Fig3一1TheexPressionveetorPEGFP一1anditsmultiPlecloningsite

第三軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文圖3-1pEGFP一l表達(dá)載體及其多克隆位點(diǎn)Fig3一1TheexPressionveetorPEGFP一1anditsmultiPlecloningsiteFig3一23一2pCAG一PPAR丫2表達(dá)載體TheexPressionveetorPCAG·PPAR丫2
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 周進(jìn)明,鄒仲敏,郭朝華,何穎,張勇,王勁,王蒙,羅成基,程天民;小鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特點(diǎn)及分化潛能鑒定[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報;2002年01期

2 王勁;DNA甲基化[J];國外醫(yī)學(xué)(臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊);2002年04期

本文編號：2847121