目的 自20世紀(jì)90年代初期神經(jīng)干細(xì)胞的概念應(yīng)用于神經(jīng)系統(tǒng)的研究以來，對神經(jīng)干細(xì)胞的研究就成為神經(jīng)科學(xué)的熱點(diǎn)，隨著神經(jīng)干細(xì)胞分離，培養(yǎng)的成功，探索其增殖，分化機(jī)制則成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，尤其是其定向分化更是倍受注目。神經(jīng)干細(xì)胞是一種多能干細(xì)胞，在體外它能在含EGF或／bFGF的無血清培養(yǎng)基中保持不斷增殖狀態(tài)，并一直保持干細(xì)胞的特性，它們在一定誘導(dǎo)因素的作用下，具有分化成星形膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元的潛能。神經(jīng)干細(xì)胞的增殖分化可受各種因素的影響，目前已知，許多細(xì)胞因子，生長因子，營養(yǎng)因子以及細(xì)胞外環(huán)境等因素的作用，可誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向不同的終末細(xì)胞分化，若能在體外分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞并在促分化因子的作用下，誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向某一特定方向分化，將為干細(xì)胞的分化機(jī)制提供有力的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)存在的纖維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，，由微管，微絲及中間絲構(gòu)成，細(xì)胞骨架不僅與細(xì)胞形態(tài)密切相關(guān)，而且參與細(xì)胞的運(yùn)動，物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)，信息傳遞以及細(xì)胞分裂，分化，基因表達(dá)等多種功能。微管是細(xì)胞骨架中最粗的一種纖維絲，在活細(xì)胞內(nèi)微管是一種動態(tài)的結(jié)構(gòu)，在一定條件下可聚合或解聚，因此細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)了各種形態(tài)的排列方式，以適應(yīng)變動的細(xì)胞質(zhì)和完成它們各自的功能。微管由α和β兩種微管蛋白聚合而成，其結(jié)構(gòu)與功能的差異可能取決于所含微管蛋白的結(jié)構(gòu)的不同。在細(xì)胞從幼稚到成熟的演變過程中，微管蛋白及微管不斷發(fā)生變化以維持生長變化的細(xì)胞形態(tài)，因此細(xì)胞形態(tài)的變化依賴于微管的結(jié)構(gòu)支持。 溶酶體是細(xì)胞內(nèi)存在的由單層界膜包繞的細(xì)胞器，內(nèi)含70多種水解酶，在細(xì)胞內(nèi)可以移動，變形，參與細(xì)胞的自體及異體吞噬，是細(xì)胞內(nèi)的消化器，通常情況下溶酶體呈圓形，具有特異性標(biāo)志酶-酸性磷酸酶(ACPase)，自1973年首次在雞胚中發(fā)現(xiàn)ACPase陽性的細(xì)管狀溶酶體后，相繼從多種細(xì)胞內(nèi)觀察到這種結(jié)構(gòu)，稱其為線狀溶酶體，兩種溶酶體被認(rèn)為是溶酶體的不同時期表現(xiàn)形式，當(dāng)其處于相對靜止時，呈現(xiàn)為圓形，當(dāng)處于激活狀態(tài)則 表現(xiàn)為線狀，而且有研究認(rèn)為，溶酶體不僅具有消化功能，而且還具運(yùn)輸作 用。 在細(xì)胞內(nèi)，細(xì)胞骨架維持著細(xì)胞形態(tài)并參與各種功能，有學(xué)者認(rèn)為微管 蛋白是細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸軌道，那么，溶酶體與微管蛋白在細(xì)胞的發(fā)育過程中有 什么樣的相關(guān)性呢，本實(shí)驗(yàn)的目的是以誘導(dǎo)皮層神經(jīng)細(xì)胞向神經(jīng)元定向分 化為基礎(chǔ)，觀察皮層干細(xì)胞在定向分化過程中即神經(jīng)元從幼稚到成熟的發(fā) 育過程中，溶酶體和微管蛋白的相互關(guān)系，希望為神經(jīng)干細(xì)胞的定向分化及 神經(jīng)元發(fā)育中的物質(zhì)運(yùn)輸提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 實(shí)驗(yàn)方法 1.新生大鼠皮層神經(jīng)干細(xì)胞原代及繼代培養(yǎng)法:取出新生24小時之內(nèi) Wistar大鼠的新生鼠，超凈工作臺下無菌刮取一薄層大腦皮層，剪碎， 0.25%胰酶消化，過濾，離心，以1一2 xl護(hù)/d密度將細(xì)胞種植在無血清培 養(yǎng)基中(DMEwF12(1:l)+10%B27+20n擴(kuò)Inl EGF+20ng/Inl bFGF)， 37℃，5%CO:孵育箱中靜置培養(yǎng)，隔日換液一次，相差顯微鏡觀察克隆形成 情況，將培養(yǎng)7日形成的克隆收集，離心制成單細(xì)胞懸液，仍以原密度種植 于上述培養(yǎng)基中進(jìn)行傳代培養(yǎng)，每7日傳代一次，共傳代3次。 2.培養(yǎng)皮層神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化:將原代及繼代培養(yǎng)獲得的神經(jīng)球收 集，離心，吹打制成單細(xì)胞懸液種植于去除EGF和bFGF并加人BDNF (Zn擴(kuò)血)，IGF一1(10n歲d)的培養(yǎng)基中進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)分化，隔日換 液，相差顯微鏡觀察細(xì)胞分化形態(tài)變化。 3.免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞，神經(jīng)元鑒定并觀察分化過程中 骨架蛋白微管蛋白(p一tubulin)的表達(dá):對原代及繼代培養(yǎng)形成的細(xì)胞克隆 進(jìn)行干細(xì)胞鑒定，用免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行Nestin組化染色，用顯微鏡觀 察。在神經(jīng)干細(xì)胞誘導(dǎo)定向分化的不同時期(1，4，7日)分別取出長有神經(jīng) 元的蓋玻片經(jīng)4%多聚甲醛固定后進(jìn)行神經(jīng)元的NSE，AchE及p屯山詛i乎的 免疫細(xì)胞化學(xué)染色，具體操作步驟按SABC試劑盒說明進(jìn)行，用光學(xué)顯微鏡 觀察結(jié)果。 4.免疫電鏡技術(shù)觀察骨架蛋白一微管蛋白(p一tubulin)在皮層神經(jīng)干細(xì) 胞定向分化過程中的時空表達(dá):對定向分化不同時期的神經(jīng)元采用免疫電 鏡技術(shù)進(jìn)行骨架蛋白(p一tub過in)的電鏡標(biāo)本制作，AO超薄切片機(jī)切片，透 射電子顯微鏡觀察p一tubtilin的分布特點(diǎn)。 5.應(yīng)用光電鏡酶細(xì)胞化學(xué)技術(shù)在光電鏡下觀察酸性磷酸酶(ACPase) 顯示的溶酶體在皮層神經(jīng)干細(xì)胞定向分化不同時期神經(jīng)元內(nèi)的分布特點(diǎn)。 6.免疫熒光技術(shù)觀察溶酶體，骨架蛋白在神經(jīng)元分化過程中時空關(guān) 系:用FITC單標(biāo)溶酶體的組織蛋白酶D和Texsc red單標(biāo)p一tub山n進(jìn)行免 疫熒光染色，熒光顯微鏡下分別觀察溶酶體和微管蛋白p一tubulin在神經(jīng)干 細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元過程中細(xì)胞內(nèi)的分布。同時用熒光雙標(biāo)技術(shù)標(biāo)記骨 架蛋白p一tubulin和組織蛋白酶D，用共焦激光掃描顯微鏡(CLSM)觀察骨 架蛋白和溶酶體的三維結(jié)構(gòu)以及二者的時空關(guān)系。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1.新生大鼠皮層神經(jīng)干細(xì)胞原代及繼代培養(yǎng)克隆的形成:取材于新生 大鼠皮層的細(xì)胞依神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)法進(jìn)行培養(yǎng)，將
【學(xué)位單位】：中國醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

赴?絞?俑魷赴?募?洌?廡┘?涑市?∏蛐紊?ぃ??胞形態(tài)規(guī)則，邊界比較清楚，未見到明顯突起(圖1)。圖1新生大鼠皮層神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)7日克隆形成及其Nes血鑒定:A:細(xì)胞克隆由數(shù)十個細(xì)胞形成，細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，無突起(4的x)。B:細(xì)胞克隆Nestin染色，呈棕色或深棕色陽性反應(yīng)(4(X)x)。繼代培養(yǎng)仍出現(xiàn)與原代培養(yǎng)相同的懸浮神經(jīng)球，形態(tài)亦與原代培養(yǎng)相同，連續(xù)傳代3次，結(jié)果無明顯改變。2.新生大鼠大腦組織中Nestin的陽性表達(dá):對新生大鼠進(jìn)行在體大腦組織中Nestin陽性表達(dá)的觀察，結(jié)果可見在新生大鼠的大腦中不同部位存在有Nestin棕色陽性反應(yīng)顆粒，以室管膜處陽性反應(yīng)明顯，其次在大腦皮層的一些區(qū)域亦有較多的棕色陽性反應(yīng)顆粒(圖2)。3.皮層神經(jīng)千細(xì)胞培養(yǎng)形成細(xì)胞克隆的Nestin鑒定:原代及繼代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)干細(xì)胞

組織中Nestin陽性表達(dá)的觀察，結(jié)果可見在新生大鼠的大腦中不同部位存在有Nestin棕色陽性反應(yīng)顆粒，以室管膜處陽性反應(yīng)明顯，其次在大腦皮層的一些區(qū)域亦有較多的棕色陽性反應(yīng)顆粒(圖2)。3.皮層神經(jīng)千細(xì)胞培養(yǎng)形成細(xì)胞克隆的Nestin鑒定:原代及繼代培養(yǎng)的皮層神經(jīng)干細(xì)胞，在6刀日形成明顯的細(xì)胞克隆后，使其貼壁生長34小時后進(jìn)行Nestin免疫細(xì)胞化學(xué)染色，結(jié)果顯示，克隆細(xì)胞呈現(xiàn)明顯陽性，原代與繼代培養(yǎng)的細(xì)胞克隆無何差異(圖1)。

細(xì)胞內(nèi)可見核仁，胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒增多。第7日細(xì)胞突起更加明顯，有的長出多條突起，NSE陽性增強(qiáng)，可見細(xì)胞突起之間開始建立聯(lián)系，神經(jīng)干細(xì)胞分化為成熟神經(jīng)元(圖3)。5.皮層神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為神經(jīng)元的鍍銀染色觀察:對皮層神經(jīng)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)定向分化為神經(jīng)元過程中的第1、4、7日進(jìn)行鍍銀染色，以觀察神經(jīng)原纖維的形成變化。其結(jié)果顯示，于分化第1日，細(xì)胞圓形或不規(guī)財(cái)形，無明顯突起，銀染纖維顯示為黑褐色，填充于胞質(zhì)之內(nèi)，密度較高。第4日細(xì)胞胞體增大，可見有突起長出，黑褐色較第1日比較，顏色較淡，略可見絲狀結(jié)構(gòu)。至第7日細(xì)胞突起明顯，可見黑褐色絲狀結(jié)構(gòu)均勻分布胞質(zhì)內(nèi)，并伸人突起中
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2846813