人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)被認為是引起人獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)的最原始病原體,它是一種感染人體免疫系統(tǒng)細胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒。本文主要研究核酶RNase P對HIV感染復(fù)制的影響和HIV與HCMV共感染這兩方面的內(nèi)容。 使用一種體外篩選程序,我們已經(jīng)篩選到一系列核酶RNase P的突變體,它們在體外可以高效的切割mRNA序列。在本研究中,我們選擇了一個突變體——它針對HIV-1的RNA序列位于基因tat區(qū)域內(nèi)。這個突變體核酶在體外切割tat RNA序列的效率比野生型核酶高20倍。這個核酶RNase P突變體的催化活性RNA來源于大腸桿菌,83位和340位核苷酸發(fā)生了突變(G83→U83，G340→A340)，我們的實驗結(jié)果第一次直接證明了這種組合突變提高了核酶切割HIV-1的RNA序列的活性。而且,在細胞內(nèi),這種突變體核酶比野生型核酶更有效的降低了HIV-1核心蛋白p24的表達和細胞內(nèi)病毒RNA的水平。在穩(wěn)定表達這種突變體核酶的細胞內(nèi),病毒RNA的水平下降了90%,病毒的生長水平下降了150倍；而在沒有表達核酶或者表達催化活性位點失去活力的核酶的細胞內(nèi),病毒RNA的水平下降不到10%。因此,我們認為基因工程改造的核酶突變體可以有效的抑制HIV的感染。這些實驗結(jié)果也表明經(jīng)過基因工程改造的核酶RNase P在抗HIV方面具有潛在的應(yīng)用價值。 利用免疫共沉淀方法,驗證由酵母雙雜交篩選到的7個HIV病毒蛋白和7個HCMV病毒蛋白之間的12對相互作用,得到兩對陽性結(jié)果,分別是tat-RLl和Nef-RLl。通過雙熒光報告基因檢測,我們發(fā)現(xiàn)RL1和tat以及RL1和Nef之間的相互作用并不影響HIV的LTR序列的轉(zhuǎn)錄活性。而RL1與pNL4-3. Luc. R-E-和pVSV-G·一起瞬時共轉(zhuǎn)進293T細胞時,隨著RL1量的增加,細胞培養(yǎng)基中HIV-1核心蛋白p24的表達量遞增。我們通過酵母雙雜交方法,篩選到與RL1相互作用的宿主細胞因子hnRNPK,免疫共沉淀和間接免疫熒光檢測也證明它們之間可以相互作用；而文獻報道hnRNPK調(diào)節(jié)HIV-1的tat/rev外顯子3的剪切過程,對HIV-1有一定的抑制作用。此外,RL1和hnRNPK一起瞬時共轉(zhuǎn)進293T細胞時,hnRNPK的表達量會隨著加入RL1的量增加而遞減。所以,在HIV和HCMV共感染時,我們推測HCMV可以通過RL1作用于hnRNPK促進HIV-1的復(fù)制。
【學(xué)位單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R373
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)
        1.1.1 人免疫缺陷病毒Ⅰ型簡介
        1.1.2 人類免疫缺陷病毒Ⅰ型反式激活因子tat
        1.1.3 HIV-1感染的危害與治療
    1.2 人巨細胞病毒(HCMV)
        1.2.1 人巨細胞病毒的簡介
        1.2.2 人巨細胞病毒的感染復(fù)制周期
        1.2.3 人巨細胞病毒的基因表達
第二章 實驗材料與方法
    2.1 實驗中使用的基本儀器、設(shè)備
    2.2 基本實驗試劑
    2.3 常規(guī)分子克隆實驗技術(shù)
        2.3.1 大腸桿菌DH5α化轉(zhuǎn)感受態(tài)細胞的制備
        2.3.2 大腸桿菌DH5α電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備
        2.3.3 大腸桿菌DH5α感受態(tài)的使用
        2.3.4 SDS堿裂解法小量抽提質(zhì)粒DNA
        2.3.5 Northern Blot實驗
        2.3.6 PCR和限制性酶切
        2.3.7 定點突變PCR
    2.4 酵母雙雜交系列實驗
        2.4.1 cDNA文庫的滴定和擴增
        2.4.2 酵母雙雜交所用培養(yǎng)基
        2.4.3 酵母感受態(tài)的制備以及酵母轉(zhuǎn)化
        2.4.4 酵母質(zhì)粒提取
        2.4.5 酵母雙雜交篩選文庫
        2.4.6 X-gal顯色實驗
    2.5 細胞水平實驗
        2.5.1 細胞培養(yǎng)基及試劑
        2.5.2 細胞培養(yǎng)(以HFF細胞為例)
        2.5.3 磷酸鈣法轉(zhuǎn)染細胞(以293T細胞為例)
        2.5.4 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細胞(以Lipofectine2000轉(zhuǎn)染Hela細胞為例)
    2.6 體外蛋白質(zhì)檢測實驗
        2.6.1 PAGE電泳和Western Blot檢測
        2.6.2 免疫共沉淀實驗
        2.6.3 間接免疫熒光實驗
    2.7 病毒水平實驗
        2.7.1 感染HFF細胞、擴增HCMV
        2.7.2 測定HCMV的病毒滴度
第三章 基因工程改造的核酶RNase P可以有效抑制人免疫缺陷病毒Ⅰ型的復(fù)制
    3.1 概述
    3.2 實驗過程和結(jié)果
        3.2.1 核酶RNase P的構(gòu)建以及其在體外切割HIV-1的tat基因RNA序列的特性研究
        3.2.2 人細胞內(nèi)瞬時表達核酶RNase P抑制HIV-1的基因表達和復(fù)制
        3.2.3 人細胞內(nèi)穩(wěn)定表達核酶RNase P抑制HIV-1病毒的產(chǎn)生
    3.3 分析與討論
第四章 人巨細胞病毒和人免疫缺陷病毒Ⅰ型間蛋白相互作用的研究
    4.1 概述
    4.2 實驗過程和結(jié)果
        4.2.1 HIV-1和HCMV病毒蛋白相互作用的Co-IP驗證
        4.2.2 HCMV病毒蛋白RL1相關(guān)的研究
        4.2.3 HCMV病毒蛋白RL1與HIV-1的Nef蛋白和tat蛋白相互作用對LTR轉(zhuǎn)錄活性的影響
        4.2.4 HCMV病毒蛋白RL1與宿主蛋白hnRNPK相互作用的驗證
        4.2.5 HCMV病毒蛋白RL1與宿主蛋白hnRNPK相互作用對HIV-1基因表達的影響
    4.3 分析與討論
參考文獻
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本文編號：2841937