人免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus, HIV)被認(rèn)為是引起人獲得性免疫缺陷綜合癥(acquired immunodeficiency syndrome, AIDS)的最原始病原體,它是一種感染人體免疫系統(tǒng)細(xì)胞的逆轉(zhuǎn)錄病毒。本文主要研究核酶RNase P對(duì)HIV感染復(fù)制的影響和HIV與HCMV共感染這兩方面的內(nèi)容。 使用一種體外篩選程序,我們已經(jīng)篩選到一系列核酶RNase P的突變體,它們?cè)隗w外可以高效的切割mRNA序列。在本研究中,我們選擇了一個(gè)突變體——它針對(duì)HIV-1的RNA序列位于基因tat區(qū)域內(nèi)。這個(gè)突變體核酶在體外切割tat RNA序列的效率比野生型核酶高20倍。這個(gè)核酶RNase P突變體的催化活性RNA來(lái)源于大腸桿菌,83位和340位核苷酸發(fā)生了突變(G83→U83，G340→A340)，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果第一次直接證明了這種組合突變提高了核酶切割HIV-1的RNA序列的活性。而且,在細(xì)胞內(nèi),這種突變體核酶比野生型核酶更有效的降低了HIV-1核心蛋白p24的表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)病毒RNA的水平。在穩(wěn)定表達(dá)這種突變體核酶的細(xì)胞內(nèi),病毒RNA的水平下降了90%,病毒的生長(zhǎng)水平下降了150倍；而在沒(méi)有表達(dá)核酶或者表達(dá)催化活性位點(diǎn)失去活力的核酶的細(xì)胞內(nèi),病毒RNA的水平下降不到10%。因此,我們認(rèn)為基因工程改造的核酶突變體可以有效的抑制HIV的感染。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明經(jīng)過(guò)基因工程改造的核酶RNase P在抗HIV方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。 利用免疫共沉淀方法,驗(yàn)證由酵母雙雜交篩選到的7個(gè)HIV病毒蛋白和7個(gè)HCMV病毒蛋白之間的12對(duì)相互作用,得到兩對(duì)陽(yáng)性結(jié)果,分別是tat-RLl和Nef-RLl。通過(guò)雙熒光報(bào)告基因檢測(cè),我們發(fā)現(xiàn)RL1和tat以及RL1和Nef之間的相互作用并不影響HIV的LTR序列的轉(zhuǎn)錄活性。而RL1與pNL4-3. Luc. R-E-和pVSV-G·一起瞬時(shí)共轉(zhuǎn)進(jìn)293T細(xì)胞時(shí),隨著RL1量的增加,細(xì)胞培養(yǎng)基中HIV-1核心蛋白p24的表達(dá)量遞增。我們通過(guò)酵母雙雜交方法,篩選到與RL1相互作用的宿主細(xì)胞因子hnRNPK,免疫共沉淀和間接免疫熒光檢測(cè)也證明它們之間可以相互作用；而文獻(xiàn)報(bào)道hnRNPK調(diào)節(jié)HIV-1的tat/rev外顯子3的剪切過(guò)程,對(duì)HIV-1有一定的抑制作用。此外,RL1和hnRNPK一起瞬時(shí)共轉(zhuǎn)進(jìn)293T細(xì)胞時(shí),hnRNPK的表達(dá)量會(huì)隨著加入RL1的量增加而遞減。所以,在HIV和HCMV共感染時(shí),我們推測(cè)HCMV可以通過(guò)RL1作用于hnRNPK促進(jìn)HIV-1的復(fù)制。
【學(xué)位單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類(lèi)】：R373
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
第一章 引言
    1.1 人免疫缺陷病毒Ⅰ型(HIV-1)
        1.1.1 人免疫缺陷病毒Ⅰ型簡(jiǎn)介
        1.1.2 人類(lèi)免疫缺陷病毒Ⅰ型反式激活因子tat
        1.1.3 HIV-1感染的危害與治療
    1.2 人巨細(xì)胞病毒(HCMV)
        1.2.1 人巨細(xì)胞病毒的簡(jiǎn)介
        1.2.2 人巨細(xì)胞病毒的感染復(fù)制周期
        1.2.3 人巨細(xì)胞病毒的基因表達(dá)
第二章 實(shí)驗(yàn)材料與方法
    2.1 實(shí)驗(yàn)中使用的基本儀器、設(shè)備
    2.2 基本實(shí)驗(yàn)試劑
    2.3 常規(guī)分子克隆實(shí)驗(yàn)技術(shù)
        2.3.1 大腸桿菌DH5α化轉(zhuǎn)感受態(tài)細(xì)胞的制備
        2.3.2 大腸桿菌DH5α電轉(zhuǎn)感受態(tài)的制備
        2.3.3 大腸桿菌DH5α感受態(tài)的使用
        2.3.4 SDS堿裂解法小量抽提質(zhì)粒DNA
        2.3.5 Northern Blot實(shí)驗(yàn)
        2.3.6 PCR和限制性酶切
        2.3.7 定點(diǎn)突變PCR
    2.4 酵母雙雜交系列實(shí)驗(yàn)
        2.4.1 cDNA文庫(kù)的滴定和擴(kuò)增
        2.4.2 酵母雙雜交所用培養(yǎng)基
        2.4.3 酵母感受態(tài)的制備以及酵母轉(zhuǎn)化
        2.4.4 酵母質(zhì)粒提取
        2.4.5 酵母雙雜交篩選文庫(kù)
        2.4.6 X-gal顯色實(shí)驗(yàn)
    2.5 細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)
        2.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)基及試劑
        2.5.2 細(xì)胞培養(yǎng)(以HFF細(xì)胞為例)
        2.5.3 磷酸鈣法轉(zhuǎn)染細(xì)胞(以293T細(xì)胞為例)
        2.5.4 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細(xì)胞(以Lipofectine2000轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞為例)
    2.6 體外蛋白質(zhì)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)
        2.6.1 PAGE電泳和Western Blot檢測(cè)
        2.6.2 免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)
        2.6.3 間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)
    2.7 病毒水平實(shí)驗(yàn)
        2.7.1 感染HFF細(xì)胞、擴(kuò)增HCMV
        2.7.2 測(cè)定HCMV的病毒滴度
第三章 基因工程改造的核酶RNase P可以有效抑制人免疫缺陷病毒Ⅰ型的復(fù)制
    3.1 概述
    3.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程和結(jié)果
        3.2.1 核酶RNase P的構(gòu)建以及其在體外切割HIV-1的tat基因RNA序列的特性研究
        3.2.2 人細(xì)胞內(nèi)瞬時(shí)表達(dá)核酶RNase P抑制HIV-1的基因表達(dá)和復(fù)制
        3.2.3 人細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)核酶RNase P抑制HIV-1病毒的產(chǎn)生
    3.3 分析與討論
第四章 人巨細(xì)胞病毒和人免疫缺陷病毒Ⅰ型間蛋白相互作用的研究
    4.1 概述
    4.2 實(shí)驗(yàn)過(guò)程和結(jié)果
        4.2.1 HIV-1和HCMV病毒蛋白相互作用的Co-IP驗(yàn)證
        4.2.2 HCMV病毒蛋白R(shí)L1相關(guān)的研究
        4.2.3 HCMV病毒蛋白R(shí)L1與HIV-1的Nef蛋白和tat蛋白相互作用對(duì)LTR轉(zhuǎn)錄活性的影響
        4.2.4 HCMV病毒蛋白R(shí)L1與宿主蛋白hnRNPK相互作用的驗(yàn)證
        4.2.5 HCMV病毒蛋白R(shí)L1與宿主蛋白hnRNPK相互作用對(duì)HIV-1基因表達(dá)的影響
    4.3 分析與討論
參考文獻(xiàn)
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本文編號(hào)：2841937