目的: 應(yīng)用分子生物學(xué)的技術(shù),探討微囊藻毒素對體外培養(yǎng)的肝細胞的損傷機制,并且對抗氧化營養(yǎng)素及B族維生素對微囊藻毒素染毒所致肝細胞的損傷的保護作用進行研究,為尋找肝臟保護與肝癌預(yù)防的有效方法提供參考。 方法: 1、購買BRL(大鼠肝細胞)細胞株,待增殖情況穩(wěn)定,開始試驗。 2、MC-LR染毒肝細胞,24小時后MTT法檢測細胞增殖情況。 3、應(yīng)用流式細胞儀檢測毒素對細胞凋亡情況的影響。 4、根據(jù)正交設(shè)計結(jié)果,BRL預(yù)先加入維生素作用,24小時后加入MC-LR染毒,檢測超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化酶(GSHPX)。 5、RT-PCR:結(jié)合正交設(shè)計實驗,篩選出有效的保護組合,通過逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù),測定目的基因PCNA和UDG在mRNA水平上的改變。 結(jié)果: 1、與正常組細胞相比,MC-LR在濃度低于1μg/ml時,促進BRL增殖,濃度為0.5μg/ml時,細胞增長達到峰值;MC-LR濃度高于1.25μg/ml時,抑制細胞增殖。 2、MC-LR染毒BRL后,細胞凋亡發(fā)生變化,當濃度在0.001～0.5μg/ml范圍,凋亡率逐漸增加,1～2.5μg/ml凋亡率逐漸減少。 3、與正常組細胞相比,不同濃度MC-LR作用下,PCNA表達量及UDG表達量差異有統(tǒng)計學(xué)意義。當MC-LR濃度在0.01～1.0μg/ml范圍內(nèi),PCNA表達量隨MC-LR濃度的增加而增加,在MC-LR濃度達到1.25μg/ml時,PCNA表達量開始下降;UDG表達的變化趨勢與PCNA一致。 4、正交分析結(jié)果顯示:與沒有維生素保護的染毒細胞相比,VitB6、VitB12、VC作用后,細胞內(nèi)SOD、GSH-PX含量增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義,并且VitB12與VC存在協(xié)同效應(yīng)。 5、在高濃度MC-LR干預(yù)下,與沒有維生素保護的染毒細胞相比,維生素B6、B12+VC作用后,PCNA表達量升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。B6、B12、B12+VC作用后,UDG表達量增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 在低濃度MC-LR干預(yù)下,與沒有維生素保護的染毒細胞相比,維生素B6、B12作用后,PCNA表達量增加,差異有統(tǒng)計學(xué)意義; B6、VC、B12、B12+VC作用后,UDG表達量減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。 結(jié)論: 1、MC-LR在不同濃度時對肝細胞增殖和凋亡的作用是不同的,在低濃度時有促進細胞增生的作用,凋亡率逐漸增加;在高濃度時卻表現(xiàn)為抑制細胞生長或細胞毒作用的表現(xiàn),凋亡率逐漸降低。 2、MC-LR通過影響B(tài)RL的PCNA和UDG基因mRNA表達,啟動BER修復(fù)途徑,可能是BRL氧化損傷后的修復(fù)機制之一。 3.維生素VitB6、FA、VitB12、VC對MC-LR致BRL損傷有保護作用,其中,維生素一階交互作用的最佳保護組合為:VitB12+ VC。
【學(xué)位單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類】：R151;R363
【部分圖文】：

結(jié) 果（一）大鼠肝細胞（BRL）的培養(yǎng)及生長曲線的繪制1、倒置顯微鏡下 BRL 生長動態(tài)觀察 72 小時如圖 1-3 所示：BRL 單層貼壁生長，互不重疊，呈鋪路石狀鑲嵌排列；細胞多角形，邊界清楚，胞漿豐富，核圓形或橢圓形，核內(nèi)染色質(zhì)稀疏空亮，核仁 1～2 個。接種 24 小時后細胞融合率約為 10~15%，48 小時后細胞融合率約為 50%，72 小時后細胞融合率約為 80~90%，可以消化傳代。

結(jié) 果（一）大鼠肝細胞（BRL）的培養(yǎng)及生長曲線的繪制1、倒置顯微鏡下 BRL 生長動態(tài)觀察 72 小時如圖 1-3 所示：BRL 單層貼壁生長，互不重疊，呈鋪路石狀鑲嵌排列；細胞多角形，邊界清楚，胞漿豐富，核圓形或橢圓形，核內(nèi)染色質(zhì)稀疏空亮，核仁 1～2 個。接種 24 小時后細胞融合率約為 10~15%，48 小時后細胞融合率約為 50%，72 小時后細胞融合率約為 80~90%，可以消化傳代。

倒置顯微鏡下BRL接種72小時
【參考文獻】

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本文編號：2840735