目的： 1．通過AdEasy系統(tǒng)和piggyBac系統(tǒng)構(gòu)建腺病毒載體和基因穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株，從而建立起穩(wěn)定、高效的目的基因調(diào)控方法。 2．通過腺病毒載體和基因穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株研究BMP-9和Nell-1基因在成骨、成脂肪方面的相互作用，從而明確Nell-1基因?qū)τ葿MP-9誘導(dǎo)的成骨和成脂肪作用的影響。 3．通過腺病毒載體調(diào)節(jié)Creld2基因表達(dá)，通過觀察成骨指標(biāo)的改變明確Creld2在BMP-9誘導(dǎo)的成骨過程中的調(diào)節(jié)作用。 方法： 1．構(gòu)建Nell-1基因腺病毒載體：通過Hi-Fi PCR擴(kuò)增Nell-1基因全序列后將其包裝入質(zhì)粒，隨后利用AdEasy系統(tǒng)在HEK293細(xì)胞中包裝Nell-1基因相關(guān)腺病毒載體，利用熒光、RT PCR以及功能檢測明確其作用。 2．構(gòu)建Nell-1基因穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株：利用piggyBac系統(tǒng)將質(zhì)粒中的Nell-1基因全序列轉(zhuǎn)座進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞基因組中，通過RT PCR和相關(guān)功能檢測明確Nell-1基因表達(dá)上調(diào)。 3．Nell-1基因?qū)MP-9功能影響：通過腺病毒載體和穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株進(jìn)行RT PCR分析成骨和成脂肪相關(guān)基因的表達(dá)，測定堿性磷酸酶活性和鈣結(jié)節(jié)染色、油紅O染色以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞周期分析檢測Nell-1基因?qū)MP-9誘導(dǎo)成骨、成脂肪作用的影響。 4．Creld2基因?qū)MP-9成骨功能的調(diào)節(jié)：通過腺病毒載體改變Creld2基因的表達(dá)，并對堿性磷酸酶活性、成骨標(biāo)志基因的表達(dá)以及鈣鹽沉積等方面進(jìn)行檢測，最后利用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分析Creld2對BMP-9誘導(dǎo)的成骨作用的影響。 結(jié)果： 1．腺病毒載體和穩(wěn)定細(xì)胞株：腺病毒載體能夠感染細(xì)胞并表達(dá)相應(yīng)熒光，通過收集腺病毒載體感染后的細(xì)胞總RNA以及穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株的總RNA，進(jìn)行RT PCR后證實(shí)目的基因表達(dá)能夠被有效調(diào)節(jié)，同時(shí)進(jìn)行ALP染色等功能試驗(yàn)與對照組也有明顯差異。 2．Nell-1基因?qū)MP-9的功能影響：（1）在體外實(shí)驗(yàn)中Nell-1基因無法有效誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞分化，但與BMP-9聯(lián)合作用后，能夠抑制由BMP-9誘導(dǎo)的ALP表達(dá)，但鈣鹽沉積明顯增強(qiáng)并能抑制由BMP-9誘導(dǎo)的成脂肪作用，當(dāng)Nell-1基因受到抑制時(shí)BMP-9誘導(dǎo)的成脂肪作用明顯加強(qiáng)。（2）在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中Nell-1無法有效誘導(dǎo)異位成骨，但與BMP-9合用后較BMP-9單獨(dú)作用雖然包塊體積略小但密度更高，染色顯示骨小梁更為粗壯、成熟，同時(shí)脂肪組織更少。 3．Creld2基因?qū)MP-9成骨功能的調(diào)節(jié)：（1）在體外實(shí)驗(yàn)中當(dāng)Creld2基因表達(dá)上調(diào)時(shí)，由BMP-9誘導(dǎo)的成骨標(biāo)志明顯表達(dá)明顯上升，但當(dāng)Creld2表達(dá)受到抑制時(shí)，成骨作用明顯減弱。（2）在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，Creld2與BMP-9聯(lián)合組包塊較BMP-9單獨(dú)組更大且骨小梁成分更多，當(dāng)Creld2被抑制由BMP-9誘導(dǎo)的成骨效果明顯變差。 結(jié)論： 1．通過AdEasy系統(tǒng)和piggBac系統(tǒng)制作腺病毒載體和穩(wěn)定高表達(dá)細(xì)胞株能夠有效調(diào)節(jié)目的基因的表達(dá)。 2．Nell-1基因能夠增強(qiáng)由BMP-9誘導(dǎo)的成骨作用，并能抑制其誘導(dǎo)的成脂肪作用。 3．Creld2對BMP-9誘導(dǎo)的成骨起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用。
【學(xué)位單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R363
【文章目錄】：
符號說明
摘要
ABSTRACT
前言
第一部分 構(gòu)建 Nell-1 基因相關(guān)腺病毒和穩(wěn)定細(xì)胞株
    1 材料與方法
    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3 討論
第二部分 Nell-1 基因?qū)?BMP-9 誘導(dǎo)成骨、成脂肪的影響
    1 材料與方法
    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3 討論
第三部分 Creld2 基因?qū)?BMP-9 成骨的調(diào)節(jié)作用
    1 材料與方法
    2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果
    3 討論
結(jié)論
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述
    參考文獻(xiàn)
引物序列
致謝
博士期間發(fā)表的論文

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 李紅玲;朱敏佳;黨懷欣;王保國;朱毅;;ATF6調(diào)節(jié)ABCA1基因的表達(dá)[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2006年10期

本文編號：2840539