目的： 1．通過AdEasy系統(tǒng)和piggyBac系統(tǒng)構建腺病毒載體和基因穩(wěn)定高表達細胞株，從而建立起穩(wěn)定、高效的目的基因調(diào)控方法。 2．通過腺病毒載體和基因穩(wěn)定高表達細胞株研究BMP-9和Nell-1基因在成骨、成脂肪方面的相互作用，從而明確Nell-1基因?qū)τ葿MP-9誘導的成骨和成脂肪作用的影響。 3．通過腺病毒載體調(diào)節(jié)Creld2基因表達，通過觀察成骨指標的改變明確Creld2在BMP-9誘導的成骨過程中的調(diào)節(jié)作用。 方法： 1．構建Nell-1基因腺病毒載體：通過Hi-Fi PCR擴增Nell-1基因全序列后將其包裝入質(zhì)粒，隨后利用AdEasy系統(tǒng)在HEK293細胞中包裝Nell-1基因相關腺病毒載體，利用熒光、RT PCR以及功能檢測明確其作用。 2．構建Nell-1基因穩(wěn)定高表達細胞株：利用piggyBac系統(tǒng)將質(zhì)粒中的Nell-1基因全序列轉(zhuǎn)座進間充質(zhì)干細胞基因組中，通過RT PCR和相關功能檢測明確Nell-1基因表達上調(diào)。 3．Nell-1基因?qū)MP-9功能影響：通過腺病毒載體和穩(wěn)定高表達細胞株進行RT PCR分析成骨和成脂肪相關基因的表達，測定堿性磷酸酶活性和鈣結節(jié)染色、油紅O染色以及動物實驗與細胞周期分析檢測Nell-1基因?qū)MP-9誘導成骨、成脂肪作用的影響。 4．Creld2基因?qū)MP-9成骨功能的調(diào)節(jié)：通過腺病毒載體改變Creld2基因的表達，并對堿性磷酸酶活性、成骨標志基因的表達以及鈣鹽沉積等方面進行檢測，最后利用動物實驗分析Creld2對BMP-9誘導的成骨作用的影響。 結果： 1．腺病毒載體和穩(wěn)定細胞株：腺病毒載體能夠感染細胞并表達相應熒光，通過收集腺病毒載體感染后的細胞總RNA以及穩(wěn)定高表達細胞株的總RNA，進行RT PCR后證實目的基因表達能夠被有效調(diào)節(jié)，同時進行ALP染色等功能試驗與對照組也有明顯差異。 2．Nell-1基因?qū)MP-9的功能影響：（1）在體外實驗中Nell-1基因無法有效誘導間充質(zhì)干細胞分化，但與BMP-9聯(lián)合作用后，能夠抑制由BMP-9誘導的ALP表達，但鈣鹽沉積明顯增強并能抑制由BMP-9誘導的成脂肪作用，當Nell-1基因受到抑制時BMP-9誘導的成脂肪作用明顯加強。（2）在動物實驗中Nell-1無法有效誘導異位成骨，但與BMP-9合用后較BMP-9單獨作用雖然包塊體積略小但密度更高，染色顯示骨小梁更為粗壯、成熟，同時脂肪組織更少。 3．Creld2基因?qū)MP-9成骨功能的調(diào)節(jié)：（1）在體外實驗中當Creld2基因表達上調(diào)時，由BMP-9誘導的成骨標志明顯表達明顯上升，但當Creld2表達受到抑制時，成骨作用明顯減弱。（2）在動物實驗中，Creld2與BMP-9聯(lián)合組包塊較BMP-9單獨組更大且骨小梁成分更多，當Creld2被抑制由BMP-9誘導的成骨效果明顯變差。 結論： 1．通過AdEasy系統(tǒng)和piggBac系統(tǒng)制作腺病毒載體和穩(wěn)定高表達細胞株能夠有效調(diào)節(jié)目的基因的表達。 2．Nell-1基因能夠增強由BMP-9誘導的成骨作用，并能抑制其誘導的成脂肪作用。 3．Creld2對BMP-9誘導的成骨起關鍵調(diào)節(jié)作用。
【學位單位】：重慶醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R363
【文章目錄】：
符號說明
摘要
ABSTRACT
前言
第一部分 構建 Nell-1 基因相關腺病毒和穩(wěn)定細胞株
    1 材料與方法
    2 實驗結果
    3 討論
第二部分 Nell-1 基因?qū)?BMP-9 誘導成骨、成脂肪的影響
    1 材料與方法
    2 實驗結果
    3 討論
第三部分 Creld2 基因?qū)?BMP-9 成骨的調(diào)節(jié)作用
    1 材料與方法
    2 實驗結果
    3 討論
結論
參考文獻
文獻綜述
    參考文獻
引物序列
致謝
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【參考文獻】

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1 李紅玲;朱敏佳;黨懷欣;王保國;朱毅;;ATF6調(diào)節(jié)ABCA1基因的表達[J];中國生物化學與分子生物學報;2006年10期

本文編號：2840539