目前，古菌日益引起了科學工作者的廣泛關(guān)注。它代表了所有最原始 生物形態(tài)的分枝，在所有的生命形態(tài)中，古菌最接近生命的原始形態(tài)。古 菌的發(fā)現(xiàn)改變了傳統(tǒng)生物分類的界限，提供了一種研究生物進化及生命起 源的新方法。研究表明，古菌在 DNA 復制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等方面與真核生 物相似；而在中央代謝（如產(chǎn)能）方面則與細菌接近。因此，研究古菌不 僅在闡明生命運動的基本規(guī)律、物種進化等方面具有重大意義，而且有助 于了解較為復雜的真核生物的一些重要生物學過程。 本文以超嗜熱古菌 Pyrococcus horikoshii OT3 為研究對象，根據(jù)其遺 傳信息，通過生物信息學方法進行分析，預測 Pyrococcus horikoshii 中的 PHS051 基因能夠表達一種具有組蛋白生物學功能的蛋白質(zhì)。由于組蛋白 在進化上十分保守，故其成為研究分子進化的很好的材料。通過對嗜熱古 菌組蛋白與大腸桿菌組蛋白以及真核組蛋白 H4 作以同源序列比較分析， 發(fā)現(xiàn)古菌組蛋白一級結(jié)構(gòu)及三級結(jié)構(gòu)的保守性，其中保守序列 ELPIAP 是 一個新的蛋白質(zhì)域，而且僅僅存在于古菌中。 首先進行古菌的小量培養(yǎng)，從中提取染色體 DNA，通過常規(guī) PCR 反 WP=147 應，釣取 PHS051 基因，將這段目的基因重組到質(zhì)粒 pET11a 中，經(jīng)酶切 鑒定及序列測定證實目的基因已經(jīng)成功的插入到質(zhì)粒 pET11a 中。將重組 質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細胞 E. coli BL21-Codon Plus 中，構(gòu)建表達古菌組蛋白 HPhA 的工程菌。但是，已構(gòu)建的組蛋白工程菌表達率較低，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn) 嗜熱古菌組蛋白基因序列中精氨酸密碼子為 AGG 或 AGA，在大腸桿菌中 的表達率極低，而組蛋白中含有 5 個精氨酸，因此可以肯定精氨酸密碼子 是表達率低的主要原因之一。由于精氨酸在古菌組蛋白中分散存在，我們 在傳統(tǒng) PCR 定點突變技術(shù)的基礎上進行了改進，參照嗜熱菌組蛋白基因 序列和大腸桿菌偏愛密碼子表，設計了一對含有 5 個精氨酸突變密碼子的 單鏈 DNA，全長為 115nt，在 3’ 端有 20nt 互補序列。將單鏈 DNA 在 94℃ 變性，45℃復性，使其互補結(jié)合，72℃進行延伸反應，得到含有突變位點 的組蛋白基因；再以此基因為模板設計相應的一對引物進行 PCR 擴增反 應，得到大量組蛋白突變基因。將突變基因克隆至表達載體 pET11a，并 轉(zhuǎn)化到宿主菌中，進行重組蛋白 HPhA 的表達，表達量提高約 2.7 倍。 工程菌在 37℃條件下進行培養(yǎng)，IPTG 誘導后降溫至 25℃過夜培養(yǎng)， 所得到的菌體經(jīng)過超聲波破碎、熱變性、PD-10 柱層析及肝素親合柱層析 得到 HPhA 純品。經(jīng) Tricine-SDS-PAGE 電泳和高效液相色譜檢測表明其 純度在 90%以上；激光解析電離飛行時間質(zhì)譜對重組蛋白 HPhA 的分子量 進行了檢測，結(jié)果為 7860.9Da，與根據(jù)氨基酸序列計算的理論值 7868.3Da 基本一致；等電聚焦實驗表明 HPhA 的等電點約為 9.07；利用酸水解法對 重組蛋白 HPhA 的氨基酸組成進行分析，結(jié)果與理論值基本一致。 在確定了重組蛋白 HPhA 理化性質(zhì)的基礎上，又對 HPhA 的生物學活 性進行研究。HPhA 能夠和 DNA 結(jié)合，形成 HPhA-DNA 復合物。通過凝 膠遷移率變動分析實驗，證明重組蛋白 HPhA 具有提高線形 DNA 在凝膠 電泳中遷移率的作用。HPhA 與 DNA 不同的質(zhì)量比，表現(xiàn)出的遷移率是 不同的。重組蛋白 HPhA 基因來源于嗜熱古菌，因此具有很強的耐熱性。 實驗表明，HPhA 具有耐高溫的特性。特別在高鹽條件下（1mol/L KCl）， WP=148 HPhA 在 95℃條件下保溫 16 小時，仍然保持與 DNA 結(jié)合的活性。重組 蛋白 HPhA 對 DNA 具有一定的的保護作用，具體表現(xiàn)為在適宜的 HPhA 濃度下，可以降低限制性內(nèi)切酶 TaqⅠ對 DNA 的降解。另外，研究表明 HPhA對線形DNA的Tm值產(chǎn)生影響，可以提高線形DNA的Tm值約20℃。 將組蛋白 HPhA 與嗜熱性古細菌組蛋白 HMfB 和嗜中溫古菌組蛋白 HFoB 比較后，分析了組蛋白 HPhA 特殊的耐熱性，發(fā)現(xiàn)并不主要在于其總體的 三維結(jié)構(gòu)，而是由于非保守序列的微小差異導致熱穩(wěn)定性的較大差異。 HPhA 中含有大量的丙氨酸、多電荷殘基、芳香類殘基和疏水性殘基，這 些都是 HPhA 具有極強的耐熱性必不可少的因素。目前正在對 HPhA 的 晶體結(jié)構(gòu)進行研究，將提供新的實驗數(shù)據(jù)，并對其耐熱機制提出更加合理 的解釋。 基因治療是從 20 世紀 80 年代發(fā)展起來的最具革命性的醫(yī)療技術(shù)。近 十年來，它作為一項全新的疾病治療手段已經(jīng)顯現(xiàn)出強大的發(fā)展勢頭。“人 類基因組計劃”的實施以及所取得的成果，不僅使人類更加清楚地了解自 身，而且為基因診斷和基因治療的研究、開發(fā)與產(chǎn)業(yè)化奠定了基礎。但是， 基因治療也存在一些問題，特別是基因載體技術(shù)嚴重限制了基因治療的發(fā) 展。組蛋白作為 DNA 結(jié)合蛋白，有可能成為一種有效的基因載體。 因為重組蛋白 HPhA 具有與組蛋白相同的功能，而且穩(wěn)定性也較好， 有可能作為外源基因的載體。通過實驗證實，HPhA 能夠與表達質(zhì)粒穩(wěn)定 的結(jié)合，形成復合物，而且可以有效的降低脫氧核糖核酸酶對外源表達質(zhì) 粒的降解，起到很好的保護作用。通過體外細胞轉(zhuǎn)染實驗，確定了 HPhA 作為基因載體介導轉(zhuǎn)染的最佳方案。為得到
【學位單位】：吉林大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2004
【中圖分類】：R346
【文章目錄】：
第一章 前 言
    1 基因治療
        1.1 基因治療概論
        1.2 基因治療的策略
        1.3 基因治療的途徑
        1.4 基因治療的基本程序
        1.5 基因治療的靶向
        1.6 非病毒基因治療的研究進展
        1.7 基因治療中有待解決的關(guān)鍵性問題
        1.8 基因治療的前景與展望
    2 組蛋白
        2.1 組蛋白在基因調(diào)控中的作用
        2.2 組蛋白的修飾
        2.3 組蛋白與染色質(zhì)的結(jié)合
        2.4 古菌組蛋白
    3 立論依據(jù)
第二章 HPhA 工程菌的構(gòu)建及表達
    1 序言
    2 儀器與材料
        2.1 主要儀器
        2.2 實驗材料
        2.3 溶液配制
    3 實驗方法
        3.1 HPhA 基因的釣取
        3.2 PCR 產(chǎn)物的酶切和純化
        3.3 質(zhì)粒載體的限制性酶切、純化及磷酸化處理
        3.4 目的基因與載體的連接
        3.5 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化
        3.6 單克隆菌株的篩選和鑒定
        3.7 工程菌的復壯及初步放大
        3.8 工程菌生長曲線
        3.9 重組蛋白 HPhA 的誘導表達
        3.10 重組蛋白突變體工程菌的構(gòu)建
        3.11 重組蛋白突變體工程菌的表達及檢測
        3.12 蛋白質(zhì)的聚丙烯酰胺凝膠電泳
    4 結(jié)果與討論
        4.1 古菌組蛋白同源序列比較分析
        4.2 超嗜熱古菌組蛋白 HPhA 基因的克隆、酶切及回收
        4.3 表達載體 pET11a 的酶切、回收及去磷酸化處理
        4.4 古菌蛋白目的基因與 pET11a 的連接、轉(zhuǎn)化及鑒定
        4.5 工程菌生長曲線的繪制
        4.6 HPhA 表達宿主菌的選擇
        4.7 HPhA 的誘導表達
        4.8 古菌組蛋白 HPhA 突變基因的獲得
        4.9 重組 T 載體構(gòu)建及鑒定
        4.10 古菌組蛋白 HPhA 突變體表達質(zhì)粒的構(gòu)建
        4.11 古菌組蛋白 HPhA 突變體表達菌株的構(gòu)建及表達
    5 小結(jié)
第三章 HPhA 的分離、純化及性質(zhì)研究
    1 序言
    2 儀器與材料
        2.1 主要儀器
        2.2 實驗材料
        2.3 溶液配制
    3 實驗方法
        3.1 HPhA 的分離純化
        3.2 Lorry 法檢測蛋白含量
        3.3 重組蛋白 HPhA 純度檢測及分子量的確定
        3.4 重組蛋白 HPhA 等電點的測定
        3.5 重組蛋白 HPhA 的氨基酸組成分析
        3.6 重組蛋白 HPhA 的園二色譜分析
    4 結(jié)果與討論
        4.1 重組蛋白 HPhA 的純化
        4.2 HPhA 蛋白含量的確定
        4.3 HPhA 的純化效率
        4.4 Tricine-SDS-PAGE
        4.5 高效液相色譜分析
        4.6 重組蛋白 HPhA 分子量測定
        4.7 重組蛋白 HPhA 的氨基酸組成分析
        4.8 HPhA 等電點的測定
        4.9 重組蛋白 HPhA 的園二色譜分析
    5 小結(jié)
第四章 HPhA 與 DNA 相互作用的研究
    1 序言
    2 實驗材料
        2.1 菌株和質(zhì)粒
        2.2 主要試劑
    3 實驗方法
        3.1 質(zhì)粒 pET21a 的制備及純化
        3.2 重組蛋白 HPhA 對質(zhì)粒 DNA Tm值的影響
        3.3 重組蛋白 HPhA 與質(zhì)粒 DNA 結(jié)合實驗分析
        3.4 HPhA 增強質(zhì)粒 DNA 抗核酸酶降解的研究
    4 結(jié)果與討論
        4.1 質(zhì)粒 pET21a 的制備及純化
        4.2 重組蛋白 HPhA 對質(zhì)粒 DNA Tm值的影響
        4.3 HPhA 與質(zhì)粒 DNA 不同質(zhì)量比對結(jié)合活性的影響
        4.4 溫度對 HPhA-DNA 結(jié)合的影響
        4.5 鹽離子濃度對 HPhA 與質(zhì)粒 DNA 結(jié)合活性的影響
        4.6 HPhA 增強質(zhì)粒 DNA 抗核酸酶降解的研究
        4.7 古菌組蛋白 HPhA 結(jié)構(gòu)分析
        4.8 古菌組蛋白 HPhA 耐熱機制的探討
    5 小結(jié)
第五章 HPhA 介導基因轉(zhuǎn)染的研究
    1 序言
    2 儀器與材料
        2.1 主要儀器
        2.2 實驗材料
        2.3 溶液配制
    3 實驗方法
        3.1 質(zhì)粒 pCMV β-gal 的制備
        3.2 質(zhì)粒 DNA-HPhA 復合物的制備
        3.3 凝膠延遲分析
        3.4 質(zhì)粒降解分析
        3.5 細胞的培養(yǎng)
        3.6 細胞轉(zhuǎn)染
        3.7 MTT 法檢測重組蛋白 HPhA 對細胞的毒性
        3.8 染色體基因組的獲得
        3.9 HBsAg 基因的擴增
        3.10 克隆載體的構(gòu)建
        3.11 表達載體的構(gòu)建
        3.12 質(zhì)粒的大量提取及純化
        3.13 重組蛋白 HPhA 介導的瞬時表達
        3.14 HBsAg 瞬時表達的檢測
        3.15 重組蛋白 HPhA 介導的乙肝核酸疫苗小鼠免疫實驗
    4 結(jié)果與討論
        4.1 質(zhì)粒 pCMV β-gal 的制備
        4.2 HPhA 的制備
        4.3 凝膠延遲分析
        4.4 質(zhì)粒降解分析
        4.5 HPhA 與質(zhì)粒不同的質(zhì)量比對轉(zhuǎn)染效率的影響
        4.6 細胞匯合度對轉(zhuǎn)染效率的影響
        4.7 保溫時間對轉(zhuǎn)染效率的影響
        4.8 鈣離子對轉(zhuǎn)染效率的影響
        4.9 不同濃度的血清對轉(zhuǎn)染效率的影響
        4.10 不同細胞株轉(zhuǎn)染效率的比較
        4.11 HPhA 對 Lipofectemine 介導細胞轉(zhuǎn)染效率的影響
        4.12 HPhA 對細胞的毒性分析
        4.13 乙肝病毒表面抗原核酸疫苗的構(gòu)建
        4.14 質(zhì)粒的大量提取和純化
        4.15 重組 HPhA 介導核酸疫苗在 COS 7 細胞中瞬時表達
        4.16 重組蛋白 HPhA 介導乙肝核酸疫苗小鼠免疫
    5 小結(jié)
結(jié) 論
參考文獻
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英文摘要

【引證文獻】

相關(guān)博士學位論文 前1條

1 李媛媛;超嗜熱古菌Pyrococcus horikoshii OT3組蛋白介導野生型p53基因治療鼻咽癌的實驗研究[D];吉林大學;2007年

本文編號：2838626