腦血栓形成是最常見的腦血管疾病之一。常常分布在腦血管相對狹 窄、彎曲、分叉或動脈粥樣硬化斑塊的溪谷處。該疾病所引起的腦梗塞治 療效果差、病殘率高，因此目前趨向于以預(yù)防血栓形成為主。血栓形成的 三要素包括：血管壁異常、血液成分改變及血流異常。針對在這些異常因 素，只有抗血小板聚集藥物-阿司匹林和噻氯匹啶（ticlopidine）對預(yù)防 腦血栓形成有一定療效。經(jīng)大規(guī)模臨床雙盲對比試驗證實，其有效率約 20～30％。因此如何提高預(yù)防腦血栓形成的有效率成為目前的研究熱 點。 在心瓣膜病合并房顫時使用阻止纖維蛋白形成的抗凝藥物（如肝素 和華法令），可降低缺血性腦血管病發(fā)病率68％～86％。說明抗凝藥物預(yù) 防血栓形成具有顯著療效。然而上述抗凝藥物易并發(fā)嚴(yán)重的出血副作 用，臨床使用時需要嚴(yán)格監(jiān)測出凝血時間，使用不方便，未能推廣 應(yīng)用于預(yù)防腦血栓形成所致的缺血性腦血管病。 近年來，組織因子（Tissue factor，TF）在促凝中的作用日益受到關(guān)注。組 織因子是內(nèi)皮細(xì)胞膜上固有的糖蛋白，它與循環(huán)中凝血因子Ⅶ相遇，形 成TF-Ⅶa復(fù)合物，活化凝血因子X，后者促進(jìn)凝血酶形成，繼之纖維 蛋白形成，導(dǎo)致血液凝固。研究表明正�；A(chǔ)狀態(tài)下TF在腦、肺、腎、 皮膚及粘膜等重要器官的血管外層細(xì)胞大量表達(dá)，以在血管破裂時保證重 要器官及時止血。血管內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞，在基礎(chǔ)狀態(tài)下不表達(dá)TF， 使血液和血管外的TF隔離，從而保證血液流動通暢，維持血液循環(huán)功能 正常。但在動脈粥樣硬化的腦血管分叉或彎曲處，隨著局部切應(yīng)力顯著變 化，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TF，觸發(fā)局部血管內(nèi)血栓形成，是觸發(fā)動脈硬化 血管內(nèi)血栓形成的主要始發(fā)因素之一。因此抑制切應(yīng)力誘導(dǎo)的TF表達(dá)是 提高預(yù)防腦血栓形成效果的主要途徑之一。 控制人 TF表達(dá)的 TF基因位于 1號染色體門 pZI—22人 CDNA全長 2．3 kb。其TF基因啟動子的3個Spl肥gr刁位點，是切應(yīng)力誘導(dǎo)啟動TF 基因轉(zhuǎn)錄的特異調(diào)節(jié)元件，即切應(yīng)力反應(yīng)元件（shear stress resPonsive element，SSRE人該元件在切應(yīng)力顯著降低、升高或紊流時與切應(yīng)力誘導(dǎo) 產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子 Egr4和 Sp結(jié)合而激活，繼之啟動 TF基因表達(dá)。因此， SSRE與轉(zhuǎn)錄因子Egr二和Spl結(jié)合是切應(yīng)力誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞TF基因表達(dá) 的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一�？梢娮钄郤SRE激活對于抑制切應(yīng)力誘導(dǎo)的TF基因表 達(dá)具有重要意義。 反基因技術(shù)所利用的形成三股螺旋的寡核昔酸krghe helix－forming ，TFOL具有特異性堿基識別能力，能夠與線狀、松弛環(huán) 狀及超螺旋狀質(zhì)粒DNA或染色體DNA結(jié)合形成三股螺旋結(jié)構(gòu)，阻止靶 DNA與調(diào)節(jié)蛋白。多聚酶、轉(zhuǎn)錄因子、甲基化酶）結(jié)合，阻止靶基因轉(zhuǎn) 錄、復(fù)制及表達(dá)。TFO是人工操縱特異基因表達(dá)的工具，寡核昔酸經(jīng)過 修飾后可直接透過生物膜，迅速分布于核內(nèi)靶基因組。己用于抗病毒、抗 腫瘤等多方面研究。本課題欲設(shè)計合成篩選在生理環(huán)境中能特異性地內(nèi)皮 細(xì)胞TF基因啟動子區(qū)SSRE結(jié)合的TFO與SSRE結(jié)合成三鏈DNA，阻 止SSRE與切應(yīng)力誘導(dǎo)的Egr1和Spl結(jié)合，從而阻止SSRE激活，導(dǎo)致 TF基因轉(zhuǎn)錄不能啟動，TF表達(dá)因而受到抑制，到達(dá)阻斷切應(yīng)力誘導(dǎo)的血 栓形成。本實驗針對SSRE的3個即l用grd位點的DNA序列，設(shè)計合 成TFO，采用電泳遷移分析篩選親和性最高的TFO、進(jìn)行硫代磷酸酯修 飾，通過同位素標(biāo)記TFO，測定其細(xì)胞內(nèi)的cpm值，確定其透膜性、耐 酶性及亞細(xì)胞分布，利用兔疫細(xì)胞化學(xué)和原位雜交方法結(jié)合圖像分析，以 及TF促凝活性測定初步確定 TFO的抑制效果，同時利用 F．a(chǎn)ctin和 G．a(chǎn)ctin 熒光染色確定切應(yīng)力作用的可靠性和穩(wěn)定性。主要結(jié)果與結(jié)論如下： 1．TF基因啟動子區(qū)的切應(yīng)力反應(yīng)元件門SRE）由3個Sp用grl位 點組成，其中第1位點位于（q5～＊、第二位點位于（七8～80X第3 ·XI· 音“ 位點位于＋56～68卜這些位點的DNA序列符合反基因技術(shù)的不典型靶序 列要求，即含有喀唆斷點的多聚瞟吟靶序列。根據(jù)反基因技術(shù)的堿基配對 規(guī)則，針對第 1位點的 DNA序列，我們設(shè)計合成了 4條 14堿基寡核昔 酸，針對第2位點，設(shè)計合成了8條ZI堿基寡核苦酸，針對第3位點， 設(shè)計合成了 2條 15堿基寡核昔酸。經(jīng)過凝膠滯留法（EMSA）篩選，每 個位點分別篩選出 1條 TFO，即第一位點為 TI 4GTa，第二位點為 TZI GTa， 第三位點為T15GTa，可見均為反向GT寡核昔酸。按其親和力大小排序 為：＊1＊W拙：3．6X IO“‘峋＞T14＊W＊d：1刀X 100M）＞T15＊W＊d：1刀丫 10’M卜將篩選出的 3條反向 GT寡核昔酸進(jìn)行硫代磷酸酯修飾，其親和 力較修飾前稍有降低J條硫代反向GT寡核昔酸親和性排序分別為：Kd：2．3 X10”’M（TZIGTa－ps）＞ Kd：3．8X10”’M（T14GTa－ps）＞ Kd：l．5X10”‘M（T15GTa－ pS）與修飾前比較，其親和性分別下降6．3、3．8、0．5（倍人該結(jié)果與其 它相關(guān)研究報告結(jié)果類?
【學(xué)位單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2001
【中圖分類】：R329.2
【文章目錄】：
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論文正文 形成三鏈DNA的寡核苷酸抑制內(nèi)皮細(xì)胞TF表達(dá)的實驗研究
    前 言
    第一部分 TFO篩選及其修飾
        材料與方法
        結(jié) 果
        討 論
    第二部分 TFO的細(xì)胞攝取率和細(xì)胞內(nèi)分布
        材料與方法
        結(jié) 果
        討 論
    第三部分 切應(yīng)力對F-actin和G-actin的影響
        材料與方法
        結(jié) 果
        討 論
    第四部分 硫代TFO對TFmRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白表達(dá)及促凝活性的影響
        材料與方法
        結(jié) 果
        討 論
    第五部分 硫代TFO對轉(zhuǎn)錄因子Sp1和Egr-1的影響
        材料與方法
        結(jié) 果
        討 論
結(jié) 論
致 謝
參考文獻(xiàn)
文獻(xiàn)綜述 形成三鏈DNA的寡核苷酸對多聚嘌吟靶序列中嘧啶斷點的識別
    參考文獻(xiàn)
發(fā)表的主要文章及論著

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1 江國偉,孫繼虎,王克強(qiáng),于彥錚,酈鳴陽;應(yīng)力培養(yǎng)對血管內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響[J];解剖學(xué)雜志;1997年03期

本文編號：2839337