腦血栓形成是最常見的腦血管疾病之一。常常分布在腦血管相對狹 窄、彎曲、分叉或動脈粥樣硬化斑塊的溪谷處。該疾病所引起的腦梗塞治 療效果差、病殘率高，因此目前趨向于以預防血栓形成為主。血栓形成的 三要素包括：血管壁異常、血液成分改變及血流異常。針對在這些異常因 素，只有抗血小板聚集藥物-阿司匹林和噻氯匹啶（ticlopidine）對預防 腦血栓形成有一定療效。經大規(guī)模臨床雙盲對比試驗證實，其有效率約 20～30％。因此如何提高預防腦血栓形成的有效率成為目前的研究熱 點。 在心瓣膜病合并房顫時使用阻止纖維蛋白形成的抗凝藥物（如肝素 和華法令），可降低缺血性腦血管病發(fā)病率68％～86％。說明抗凝藥物預 防血栓形成具有顯著療效。然而上述抗凝藥物易并發(fā)嚴重的出血副作 用，臨床使用時需要嚴格監(jiān)測出凝血時間，使用不方便，未能推廣 應用于預防腦血栓形成所致的缺血性腦血管病。 近年來，組織因子（Tissue factor，TF）在促凝中的作用日益受到關注。組 織因子是內皮細胞膜上固有的糖蛋白，它與循環(huán)中凝血因子Ⅶ相遇，形 成TF-Ⅶa復合物，活化凝血因子X，后者促進凝血酶形成，繼之纖維 蛋白形成，導致血液凝固。研究表明正�；A狀態(tài)下TF在腦、肺、腎、 皮膚及粘膜等重要器官的血管外層細胞大量表達，以在血管破裂時保證重 要器官及時止血。血管內內皮細胞和單核細胞，在基礎狀態(tài)下不表達TF， 使血液和血管外的TF隔離，從而保證血液流動通暢，維持血液循環(huán)功能 正常。但在動脈粥樣硬化的腦血管分叉或彎曲處，隨著局部切應力顯著變 化，誘導內皮細胞表達TF，觸發(fā)局部血管內血栓形成，是觸發(fā)動脈硬化 血管內血栓形成的主要始發(fā)因素之一。因此抑制切應力誘導的TF表達是 提高預防腦血栓形成效果的主要途徑之一。 控制人 TF表達的 TF基因位于 1號染色體門 pZI—22人 CDNA全長 2．3 kb。其TF基因啟動子的3個Spl肥gr刁位點，是切應力誘導啟動TF 基因轉錄的特異調節(jié)元件，即切應力反應元件（shear stress resPonsive element，SSRE人該元件在切應力顯著降低、升高或紊流時與切應力誘導 產生的轉錄因子 Egr4和 Sp結合而激活，繼之啟動 TF基因表達。因此， SSRE與轉錄因子Egr二和Spl結合是切應力誘導內皮細胞TF基因表達 的關鍵環(huán)節(jié)之一。可見阻斷SSRE激活對于抑制切應力誘導的TF基因表 達具有重要意義。 反基因技術所利用的形成三股螺旋的寡核昔酸krghe helix－forming ，TFOL具有特異性堿基識別能力，能夠與線狀、松弛環(huán) 狀及超螺旋狀質粒DNA或染色體DNA結合形成三股螺旋結構，阻止靶 DNA與調節(jié)蛋白。多聚酶、轉錄因子、甲基化酶）結合，阻止靶基因轉 錄、復制及表達。TFO是人工操縱特異基因表達的工具，寡核昔酸經過 修飾后可直接透過生物膜，迅速分布于核內靶基因組。己用于抗病毒、抗 腫瘤等多方面研究。本課題欲設計合成篩選在生理環(huán)境中能特異性地內皮 細胞TF基因啟動子區(qū)SSRE結合的TFO與SSRE結合成三鏈DNA，阻 止SSRE與切應力誘導的Egr1和Spl結合，從而阻止SSRE激活，導致 TF基因轉錄不能啟動，TF表達因而受到抑制，到達阻斷切應力誘導的血 栓形成。本實驗針對SSRE的3個即l用grd位點的DNA序列，設計合 成TFO，采用電泳遷移分析篩選親和性最高的TFO、進行硫代磷酸酯修 飾，通過同位素標記TFO，測定其細胞內的cpm值，確定其透膜性、耐 酶性及亞細胞分布，利用兔疫細胞化學和原位雜交方法結合圖像分析，以 及TF促凝活性測定初步確定 TFO的抑制效果，同時利用 F．actin和 G．actin 熒光染色確定切應力作用的可靠性和穩(wěn)定性。主要結果與結論如下： 1．TF基因啟動子區(qū)的切應力反應元件門SRE）由3個Sp用grl位 點組成，其中第1位點位于（q5～＊、第二位點位于（七8～80X第3 ·XI· 音“ 位點位于＋56～68卜這些位點的DNA序列符合反基因技術的不典型靶序 列要求，即含有喀唆斷點的多聚瞟吟靶序列。根據(jù)反基因技術的堿基配對 規(guī)則，針對第 1位點的 DNA序列，我們設計合成了 4條 14堿基寡核昔 酸，針對第2位點，設計合成了8條ZI堿基寡核苦酸，針對第3位點， 設計合成了 2條 15堿基寡核昔酸。經過凝膠滯留法（EMSA）篩選，每 個位點分別篩選出 1條 TFO，即第一位點為 TI 4GTa，第二位點為 TZI GTa， 第三位點為T15GTa，可見均為反向GT寡核昔酸。按其親和力大小排序 為：＊1＊W拙：3．6X IO“‘峋＞T14＊W＊d：1刀X 100M）＞T15＊W＊d：1刀丫 10’M卜將篩選出的 3條反向 GT寡核昔酸進行硫代磷酸酯修飾，其親和 力較修飾前稍有降低J條硫代反向GT寡核昔酸親和性排序分別為：Kd：2．3 X10”’M（TZIGTa－ps）＞ Kd：3．8X10”’M（T14GTa－ps）＞ Kd：l．5X10”‘M（T15GTa－ pS）與修飾前比較，其親和性分別下降6．3、3．8、0．5（倍人該結果與其 它相關研究報告結果類?
【學位單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2001
【中圖分類】：R329.2
【文章目錄】：
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中文摘要
論文正文 形成三鏈DNA的寡核苷酸抑制內皮細胞TF表達的實驗研究
    前 言
    第一部分 TFO篩選及其修飾
        材料與方法
        結 果
        討 論
    第二部分 TFO的細胞攝取率和細胞內分布
        材料與方法
        結 果
        討 論
    第三部分 切應力對F-actin和G-actin的影響
        材料與方法
        結 果
        討 論
    第四部分 硫代TFO對TFmRNA轉錄、蛋白表達及促凝活性的影響
        材料與方法
        結 果
        討 論
    第五部分 硫代TFO對轉錄因子Sp1和Egr-1的影響
        材料與方法
        結 果
        討 論
結 論
致 謝
參考文獻
文獻綜述 形成三鏈DNA的寡核苷酸對多聚嘌吟靶序列中嘧啶斷點的識別
    參考文獻
發(fā)表的主要文章及論著

【參考文獻】

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1 江國偉,孫繼虎,王克強,于彥錚,酈鳴陽;應力培養(yǎng)對血管內皮細胞形態(tài)結構的影響[J];解剖學雜志;1997年03期

本文編號：2839337