特絡(luò)細胞(telocytes)是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種間充質(zhì)來源的間質(zhì)細胞,由羅馬尼亞L. M. Popescu教授在2005年首次確認,并于2010年正式命名。特絡(luò)細胞已被證實存在于哺乳動物體內(nèi)幾乎各種器官及組織中。特絡(luò)細胞形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)與其他間質(zhì)細胞如成纖維細胞、間充質(zhì)干細胞等有著顯著不同,其具有特征性的串珠樣細胞突起,可形成3D網(wǎng)絡(luò)支架結(jié)構(gòu)。 通過組織學(xué)和免疫學(xué)的方法已經(jīng)證實特絡(luò)細胞表面陽性表達CD34、c-kit、 vimentin,與各種固有細胞如成纖維細胞、免疫細胞、神經(jīng)細胞等互相接觸,參與細胞間的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),尤其是與干細胞關(guān)系密切,可能發(fā)揮著“干細胞輔助細胞”的功能參與組織的損傷修復(fù)過程。但是限于在細胞分離、純化、培養(yǎng)等方面的諸多困難,對特絡(luò)細胞功能學(xué)的研究非常緩慢,目前大多數(shù)研究僅局限于組織學(xué)及形態(tài)學(xué)方面,僅有少數(shù)專注于細胞生物學(xué)功能方面的研究,而且還只是基于細致的組織學(xué)觀察而得出的推論和假設(shè),尚缺乏體內(nèi)、體外的細胞實驗進行論證。 我們認為某種細胞的結(jié)構(gòu)及其組織分布特征必然與其功能相適應(yīng),因此在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上,本課題應(yīng)用組織學(xué)、細胞分子生物學(xué)、基因組學(xué)等方法,著重研究特絡(luò)細胞在肺臟的定位和分布特征,揭示肺臟特絡(luò)細胞與其他間質(zhì)細胞的差異,以及與干細胞的聯(lián)系,闡述其可能的細胞生物學(xué)功能,為進一步應(yīng)用特絡(luò)細胞治療肺部疾病奠定理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。 第一部分 肺臟特絡(luò)細胞的定位與分離培養(yǎng) 目的： 明確特絡(luò)細胞是否存在于肺臟中,揭示特絡(luò)細胞在氣管和肺組織中的分布特征,研究特絡(luò)細胞的形態(tài)學(xué)特征及體外培養(yǎng)的動態(tài)變化。 方法： 通過電子顯微鏡技術(shù)、免疫組織化學(xué)技術(shù)在肺組織中定位特絡(luò)細胞；體外分離小鼠/人肺特絡(luò)細胞,通過原代細胞培養(yǎng)、活細胞染色等觀察肺特絡(luò)細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)；通過Cell-IQ活細胞工作站動態(tài)觀察肺特絡(luò)細胞在體外培養(yǎng)過程中的形態(tài)學(xué)變化；采用流式細胞技術(shù)分析特絡(luò)細胞的表面生物標記物。 結(jié)果： 掃描及透射電鏡在小鼠氣管軟骨、平滑肌之間的間隙中找到了特絡(luò)細胞,其胞體帶有細長的突起telopode;透射電鏡發(fā)現(xiàn)特絡(luò)細胞位于肺間質(zhì),緊鄰毛細血管及小支氣管,在肺干細胞周圍存在大量特絡(luò)細胞。Telopode呈管腔樣結(jié)構(gòu),厚薄交替。免疫組化證實特絡(luò)細胞是CD34、c-kit、vimentin陽性細胞。從肺組織中分離、培養(yǎng)的細胞具有典型的特絡(luò)細胞特征。流式細胞檢測分析發(fā)現(xiàn),人肺特絡(luò)細胞表面CD44, CD73, CD90, CD105為陽性,CD34、CD11b、CD19、CD45、 HLA-DR表型結(jié)果均為陰性,與人骨髓間充質(zhì)干細胞表型一致。體外細胞培養(yǎng)96小時的連續(xù)動態(tài)觀察提示特絡(luò)細胞具有游走性、趨化性,細胞間可形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),可釋放顆粒物質(zhì),也可以吞噬其他特絡(luò)細胞釋放的顆粒物質(zhì)。 結(jié)論： 氣管和肺組織中也廣泛存在特絡(luò)細胞,其分布具有特征性,參與小血管和小支氣管的支架結(jié)構(gòu),與肺泡上皮細胞以及肺干細胞關(guān)系密切。人肺特絡(luò)細胞與人骨髓間充質(zhì)干細胞表達相同的生物標記物,特絡(luò)細胞具有干細胞的特性。特絡(luò)細胞之間可以形成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),可能參與細胞間的信號傳遞。 第二部分肺臟特絡(luò)細胞與纖維細胞、間充質(zhì)干細胞的基因差異分析 目的： 探索特絡(luò)細胞與其他間質(zhì)細胞之間的基因差異,找出其特異性表達的基因,明確特絡(luò)細胞是否為一類新的間質(zhì)細胞。 方法： 分離、培養(yǎng)小鼠肺特絡(luò)細胞,與小鼠肺成纖維細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞一起分別做全基因表達譜分析,對比三種細胞之間的基因表達,尋找其中的差異基因和共表達基因。 結(jié)果： 與小鼠成纖維細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞相比較,小鼠特絡(luò)細胞有2000個基因高表達,有超過4000個基因低表達。在這數(shù)千個基因中,三種細胞共同表達的基因有156個,進一步通過String Network分析發(fā)現(xiàn)其中又有46個基因之間有不同程度的關(guān)聯(lián)性,而小鼠特絡(luò)細胞特異性表達Rbp1基因。差異基因主要體現(xiàn)在細胞的發(fā)生、生長過程,解剖與形態(tài)結(jié)構(gòu)等方面。 結(jié)論： 特絡(luò)細胞的基因表達與成纖維細胞、骨髓間充質(zhì)干細胞差異巨大,尤其是特異性表達Rbp1基因。特絡(luò)細胞是一類新的間質(zhì)細胞 第三部分 肺臟特絡(luò)細胞對血管內(nèi)皮細胞的損傷修復(fù)作用 目的： 探索特絡(luò)細胞是否能夠合成分泌與血管生成相關(guān)的細胞因子,研究特絡(luò)細胞是否能促進血管內(nèi)皮細胞的增殖,促進血管內(nèi)皮細胞的損傷修復(fù)。 方法： 分離、培養(yǎng)小鼠/人肺特絡(luò)細胞,分別培養(yǎng)24、48小時,用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清液中細胞因子VEGF, EGF, TNF-α, IFN-γ, GM-CSF, MCP-1, TIMP-1, TIMP-2水平；分別以DMEM完全培養(yǎng)基和特絡(luò)細胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng)人肺微血管內(nèi)皮細胞,檢測細胞增殖能力；以脂多糖刺激人肺微血管內(nèi)皮細胞,分別以DMEM完全培養(yǎng)基和特絡(luò)細胞條件培養(yǎng)基培養(yǎng),用Matrigel膠法檢測微血管內(nèi)皮細胞的小管生成能力。 結(jié)果： 小鼠/人肺特絡(luò)細胞培養(yǎng)上清液中與血管生成相關(guān)的細胞因子水平升高,尤其是VEGF、EGF。與對照組相比,人肺特絡(luò)細胞條件培養(yǎng)基提高了人肺微血管內(nèi)皮細胞的增殖能力；與對照組相比,人肺特絡(luò)細胞條件培養(yǎng)基促進了LPS損傷后的人肺微血管內(nèi)皮細胞的小管生成能力。 結(jié)論： 特絡(luò)細胞可以分泌VEGF、EGF,促進血管內(nèi)皮細胞的增殖和損傷修復(fù)。
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

特絡(luò)細胞被成功的從肺組織中分離并體外培養(yǎng)，培養(yǎng)3-4天后可以在普通光學(xué)顯微鏡下觀察到典型形態(tài)特征（圖5:①)。在不同的染色條件下，細胞顯示出相同的形態(tài)特征。亞甲基藍染色（圖5:②）和吉姆薩染色（圖4:③）顯K telopode很長，從細胞胞體延伸出去，管腔H凸不平，遠端逐漸變細；薄厚相間，如同念珠狀。詹姆斯綠B是一種活細胞染料，與細胞內(nèi)線粒體有很高的結(jié)合力，因此常被用來定位線粒體�；罴毎旧l(fā)現(xiàn)，特絡(luò)細胞胞體及telopode富含線粒體（圖5:④）。線粒體綠色焚光探針常被用于鑒定細胞內(nèi)的線粒體,通過對細胞的標記，可見特絡(luò)細胞胞體及telpode中富含線粒體，提示線粒體占了大部分體積，因此特絡(luò)細胞可能是一個“巨大的動力工廠”（圖5:⑤、⑥)。圖5:小鼠肺臟原代培養(yǎng)的特絡(luò)細胞(TC)細胞及其突起telopodeCTp)
【共引文獻】

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本文編號：2838394