目的 構(gòu)建穩(wěn)定的高血壓病證結(jié)合動物模型,探尋臨床四診信息和模型動物的相似性和關(guān)聯(lián)性,尋找能夠反映高血壓肝火亢盛證動物模型相對應的替代指征,明確其較為穩(wěn)定的證候時間窗。結(jié)合高血壓疾病與證候特征性基因共發(fā)生網(wǎng)絡和高血壓病證候與理化指標的文獻研究結(jié)果,建立高血壓肝火亢盛證宏觀與微觀相結(jié)合的特征性證候判別模式,初步揭示高血壓肝火亢盛證的生物學基礎,為高血壓病的客觀化診斷提供依據(jù),為高血壓中醫(yī)藥研發(fā)及藥效學評價提供可靠的載體,搭建中醫(yī)基礎研究與臨床研究溝通的橋梁。 方法 1采用GenCLip2.0online platform實時從Pubmed全文數(shù)據(jù)庫中檢索與原發(fā)性高血壓相關(guān)的所有文獻,對高血壓病異常表達基因進行功能聚類分析,構(gòu)建高血壓疾病和證候的特異性基因共發(fā)生網(wǎng)絡。 2結(jié)合KEGG通路富集分析、GO-ANALYSIS等文獻挖掘技術(shù),探尋高血壓密切相關(guān)基因調(diào)控通路及蛋白信號分子,進一步構(gòu)建高血壓與應激相關(guān)基因的共發(fā)生網(wǎng)絡。 3運用復雜系統(tǒng)熵數(shù)據(jù)挖掘技術(shù),對高血壓常見證型與理化指標之間的復雜關(guān)聯(lián)性進行分析,從密切關(guān)聯(lián)的指標中探尋不同證型高血壓病的共性病理改變以及反映不同證型特有病理特征的核心指標。 4采用目前文獻報道的與人類原發(fā)性高血壓最為相似的2種高血壓疾病模型：自發(fā)性高血壓大鼠模型及應激性高血壓大鼠模型,通過全面動態(tài)宏觀表征采集、行為學試驗以及微觀理化指標的動態(tài)檢測,進行疾病的穩(wěn)定性評價,并結(jié)合臨床四診信息與動物表征的等效轉(zhuǎn)化,進行證候?qū)傩缘谋孀R。5基于現(xiàn)代社會人們所遭受的各種慢性社會、心理應激等高血壓危險因子,分別給予高血壓肝火亢盛證大鼠慢性溫和應激和反復強烈應激,觀測其應激狀態(tài)下的宏觀表征、行為學及微觀理化指標的變化。 6采用Elisa法檢測大鼠血清中文獻研究結(jié)果所提示的與高血壓證候密切相關(guān)的微觀理化指標,免疫組織化學法對大鼠腦區(qū)的單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的表達進行定位分析,高效液相色譜法(HPLC)進行定量分析。 7運用氫核磁共振(1H-NMR)技術(shù)對高血壓肝火亢盛證大鼠及其應激狀態(tài)下血漿中的內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物的進行全面鑒定和差異性比較分析。 結(jié)果 1基因?qū)用妗哐獕杭膊∨c證候及應激調(diào)控基因的文獻研究結(jié)果 原發(fā)性高血壓(EH)密切相關(guān)前100位基因功能聚類分析結(jié)果：動態(tài)血壓(晝夜節(jié)律)主要受ACE,AGT,AGTR1,ALB,AVP,B2M,CAT,CRP, EEF1A2,FLNA,LEP,NOVA2,PTH,REN,SOD1,TNF等基因調(diào)控；調(diào)控腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)系統(tǒng)及交感神經(jīng)系統(tǒng)活性的基因：ACE, ACE2, ADIPOQ, AGT, AGTR1, ALB, APOE, AVP, CCL2, CRP, CYP11B2, DBP, EDN1, EEF1A2, ELN, EPO, FOXD3, HMGCR, ICAM1, IGF1, IL1B, IL6,REN等；與血管內(nèi)皮功能障礙相關(guān)的基因有ACE,ADIPOQ, AGT, AKT1, ALB, APOE, B2M, CALCA, CAT, CCL2, CD59, CRP, MAPK1, MME, NOS1, NOS3等。 EH密切相關(guān)基因KEGG_PATHWAY通路富集結(jié)果：Renin-angiotensin system:ACE, REN, ACE2, MME, AGT, LNPEP, AGTR1; Aldosterone-regulated sodium reabsorption: MAPK1, HSD11B1, NR3C2, HSD11B2, IGF1, INSR; Cytokine-cytokine receptor interaction Calcium signaling pathway:EDNRA,AGTR1, ADRB2, NOS1, ADRB1, NOS3, NOS2, HTR2A; NOD-like receptor signaling pathway:MAPK1, CARD8, IL6, TNF, CCL2, IL1B。 EH前100位基因中有61位基因與機體對外界應激的反應、機體內(nèi)氧化應激反應以及應激保護等機制相關(guān),其中20位基因與機體對外界的應激反應相關(guān)。 以高血壓密切關(guān)聯(lián)基因為背景基因,以高血壓肝火亢盛證診斷標準中癥狀所對應的西醫(yī)名稱為關(guān)鍵詞進行基因聚類分析,發(fā)現(xiàn)其中與高血壓肝火亢盛證密切關(guān)聯(lián)的基因主要為RAAS系統(tǒng)關(guān)鍵級聯(lián)基因REN, ACE, AGT以及細胞色素P450家族CYP2D6。 2微觀理化指標層面—高血壓證候相關(guān)理化指標文獻研究結(jié)果 文獻研究結(jié)果提示與高血壓肝火亢盛證型關(guān)聯(lián)性較強的理化指標主要有超聲心動、丙二醛、血栓素A2、前列腺素、血栓素B2、ACE、內(nèi)皮素等;甘油三酯、低密度脂蛋白、頸動脈斑塊積分、高密度脂蛋白及頸動脈內(nèi)膜—中膜厚度等指標與高血壓痰濕壅盛證型關(guān)聯(lián)性較強提示該證型的脂質(zhì)代謝紊亂最為顯著；高血壓陰虛陽亢證中24h動態(tài)血壓信息量化值最大,提示改證型血壓變異性最為顯著；而陰陽兩虛證中與LEVF值的降低相關(guān)性最強,提示該證型心功能下降最為顯著。 3高血壓動物模型疾病的穩(wěn)定性評價： 應激性大鼠模型血壓隨應激強度及時間的增加波動明顯,血壓呈短暫性的升高,去除應激因子2周后,血壓低于140mmHg診斷標準。其病情與應激強度及時間有明顯的相關(guān)性,且有自然恢復趨勢。 自發(fā)性高血壓大鼠12周齡時血壓已明顯升高SBP波動在176mmHg,血壓隨周齡增長持續(xù)升高,至14-18周齡達到相對穩(wěn)定的水平,疊加反復強烈應激后,血壓升高幅度更大。病情相對穩(wěn)定,因此可作為中醫(yī)證候觀察及中藥藥效學評價的首選模型。 4高血壓動物模型證候?qū)傩耘袆e： 自發(fā)性高血壓大鼠于14-18周齡出現(xiàn)易激惹程度評分明顯增加,旋轉(zhuǎn)耐受時間縮短,耳、爪部血管數(shù)量增多及充盈度增加,舌、爪部圖像R值升高、舌質(zhì)干少津、被毛干枯蓬亂,便質(zhì)干硬、排便時間延長,曠場試驗總活動距離、穿格次數(shù)及直立次數(shù)明顯增加。參照高血壓證候診斷標準,基于臨床證候診斷標準進行動物宏觀表征表征等效轉(zhuǎn)化的方法,初步認為SHR14-18周齡符合肝火亢盛證的診斷標準。 應激性高血壓大鼠,組內(nèi)個體差異較大,應激后大鼠血壓升高的程度與應激時間并不同步,而宏觀表征及行為學等表現(xiàn)組內(nèi)差異更為明顯,癥狀輕重程度不一,證候的穩(wěn)定性、均一性較差。 5高血壓肝火亢盛證大鼠及其應激狀態(tài)下外周血管活性物質(zhì)差異性分析 14-18周齡SHR(肝火亢盛證)大鼠血清AngⅡ、NE、TXB2、ET、NPY、HCY、CORT含量均與12、13、20周齡(非肝火亢盛證)相比有明顯差異,而5-HT、CGRP、6-Keto-PGF1α等指標未見明顯差異。高血壓肝火亢盛證大鼠應激干預后血清中ET、AneⅡ、HCY、NPY、5-HT、NE、CORT等水平明顯高于無干預組高血壓肝火亢盛證大鼠。 6高血壓肝火亢盛證大鼠及其應激狀態(tài)下中樞單胺類神經(jīng)遞質(zhì)含量分析 高血壓肝火亢盛證大鼠海馬組織內(nèi)除E含量與正常大鼠無明顯差異外,其他指標NE、DOPAC、DA、5-HIAA、HVA、5-HT含量均較正常組大鼠顯著升高,且應激狀態(tài)下高血壓肝火亢盛證大鼠NE含量升高更為顯著。 7高血壓肝火亢盛證大鼠及其應激狀態(tài)下1H-NMR血漿代謝產(chǎn)物的比較分析 1H-NMR圖譜及模式識別分析發(fā)現(xiàn)：自發(fā)性高血壓大鼠與正常組大鼠OPLS/O2PLS-DA積分矩陣圖沿第一主成分t(1)軸方向均可完全分開,且無明顯交叉和重疊,表明自發(fā)性高血壓大鼠與正常組大鼠血漿成分代謝產(chǎn)物譜有顯著性差異。同時研究發(fā)現(xiàn)14-18w高血壓肝火亢盛證大鼠給予應激干預后：反復強烈應激組與無干預組血漿成分代謝產(chǎn)物有明顯差異,而正常組大鼠給予應激干預后不論是溫和應激還是反復強烈應激組血漿代謝產(chǎn)物與對照組相比均無明顯差異。 結(jié)論 1本研究采用文獻挖掘與數(shù)據(jù)挖掘相結(jié)合的方法,構(gòu)建了高血壓疾病基因網(wǎng)絡,證候關(guān)聯(lián)基因及關(guān)聯(lián)微觀理化指標,從基因?qū)用婧臀⒂^理化指標層面為高血壓證候生物學基礎研究提供了新的方法。 2選擇與人類原發(fā)性高血壓發(fā)病機制相似的自發(fā)性高血壓大鼠模型和應激性高血壓大鼠模型,通過全面動態(tài)宏觀表征采集和行為學評價,以高血壓臨床證候診斷標準為依據(jù)進行臨床信息與動物表征的等效轉(zhuǎn)化,初步辨識其證候?qū)傩?并結(jié)合微觀理化指標及代謝組學與證候的相關(guān)性分析,建立了宏觀表征與微觀指標相結(jié)合的高血壓肝火亢盛證判別模式。 3高血壓肝火亢盛證大鼠及其應激狀態(tài)下微觀理化指標的改變及其關(guān)聯(lián)性分析,提示高血壓肝火亢盛證可能的生物學機制為RAAS系統(tǒng)的激活和交感神經(jīng)活性的增強—“高腎上腺素能特征”和多巴胺能亢進以及相繼發(fā)生的血管內(nèi)皮功能障礙。初步認為AngⅡ、 NE、ET、TXB2可作為肝火亢盛證的客觀化診斷指標。1H-NMR模式分析提示差異代謝物與證候及證候相關(guān)理化指標之間存在相關(guān)性,有望成為證候客觀化診斷的指標。
【學位單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R259;R-332
【文章目錄】：
目錄
中文摘要
Abstract
第一部分 文獻綜述
    綜述一 高血壓疾病動物模型的研究進展
        小結(jié)
    綜述二 高血壓中醫(yī)證候模型研究現(xiàn)狀
        參考文獻
第二部分 文獻研究
    一、基于GenCLip基因挖掘技術(shù)高血壓疾病與證候分子網(wǎng)絡研究
        前言
        1. 資料與方法
        2. 結(jié)果
        3. 討論
    二、基于復雜系統(tǒng)熵的高血壓病中醫(yī)證候與理化指標相關(guān)性研究
        前言
        1. 資料與方法
        2. 結(jié)果
        3. 討論
    參考文獻
第三部分 實驗研究
    前言
    實驗一 大鼠高血壓病證結(jié)合動物模型的構(gòu)建及證候評價
        1. 材料與方法
        2. 結(jié)果
        3. 討論
    實驗二 高血壓肝火亢盛證大鼠及其應激狀態(tài)下外周血管活性物質(zhì)的比較研究
        1. 材料與方法
        2. 結(jié)果
        3. 討論
    實驗三 高血壓肝火亢盛證大鼠及其應激狀態(tài)下中樞神經(jīng)遞質(zhì)含量變化的研究
        1. 材料與方法
        2. 結(jié)果
        3. 討論
    實驗四 高血壓肝火亢盛證大鼠及其應激狀態(tài)血漿代謝組學研究
        1. 材料與方法
        2. 結(jié)果
        3. 討論
    實驗小結(jié)
    參考文獻
結(jié)論
本課題的特色與創(chuàng)新
圖版
附錄
致謝
個人簡歷

【參考文獻】

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本文編號：2836187