胚胎著床是成功妊娠的第一步，受到激素、細(xì)胞因子、蛋白、酶等多種信息物質(zhì)的調(diào)節(jié)，詳細(xì)機(jī)理尚不清楚。由于著床的機(jī)理不清，阻礙了對(duì)不孕這種與著床密切相關(guān)疾病的深入了解，阻礙了助孕技術(shù)水平的提高，同時(shí)也阻礙了抗著床干擾生育方法的進(jìn)一步開發(fā)。著床涉及胚胎和母體子宮雙方的同步發(fā)展和變化，是一個(gè)復(fù)雜而精細(xì)的過程，直接在體研究極其困難，因此，體外模型的建立成為研究此過程的重要工具。目前國內(nèi)外應(yīng)用子宮組織、子宮內(nèi)膜細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)等已建立了許多著床模型，其中應(yīng)用最多的是胚泡與單層子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的共培養(yǎng)。但這些模型絕大多數(shù)只能實(shí)現(xiàn)胚泡的粘附和擴(kuò)展生長，而無胚泡植入子宮內(nèi)膜的行為。即都不能完全模擬體內(nèi)著床時(shí)胚泡與子宮內(nèi)膜的關(guān)系。研究表明子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的極性、細(xì)胞間連接以及與基質(zhì)細(xì)胞、細(xì)胞間基質(zhì)的關(guān)系對(duì)于維持子宮內(nèi)膜的功能非常重要，因此植入過程的研究中，除包含基底膜上有良好細(xì)胞間連接的極性上皮細(xì)胞外，同時(shí)包含細(xì)胞間基質(zhì)和基質(zhì)細(xì)胞也很重要。鑒于這些特點(diǎn)，建立含有子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)細(xì)胞的體外培養(yǎng)三維模型，系統(tǒng)觀察子宮內(nèi)膜細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、細(xì)胞骨架的改變，并進(jìn)一步利用此體外模型觀察雌激素、胚胎以及細(xì)胞因子等對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)節(jié)作用，對(duì)闡明子宮內(nèi)膜容受性建立的分子機(jī)制，并通過干擾容受性來干擾著床從而實(shí)現(xiàn)人類生育調(diào)節(jié)具有重要意義。體外模型的建立能夠?yàn)檠芯颗咛ブ蔡峁└侠�、更科學(xué)和更便捷的途經(jīng)。 第一部分 子宮內(nèi)膜體外三維模型的建立 一、 子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)三維模型 目的 用雙室培養(yǎng)系統(tǒng)、Matrigel的特性，建立子宮內(nèi)膜上皮/基質(zhì)細(xì)胞的共培養(yǎng)三維模型，并進(jìn)一步觀察其形態(tài)學(xué)特征并與在體子宮內(nèi)膜相比較，探索建立理想的體外三維模型。 材料和方法 取孕4天小鼠子宮內(nèi)膜，用trypsin/pancreatin消化法制備子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞 WP=6 和基質(zhì)細(xì)胞，利用雙室培養(yǎng)系統(tǒng)建立含有上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的三維模型。用光鏡、電鏡觀察其形態(tài)學(xué)特征，并與正常子宮內(nèi)膜比較；用細(xì)胞免疫組化方法鑒定細(xì)胞的來源和純度。 結(jié)果 用酶消化法分離的上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞，其純度占90％以上。掃描電鏡（SEM）觀察顯示，對(duì)照組孕第4天的小鼠子宮蛻膜上皮細(xì)胞有突起，表面具有微絨毛及發(fā)育中的胞飲突。體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞生長融合成片，同樣可見容受性標(biāo)志－發(fā)育中胞飲突的形成，上覆微絨毛，只是體外培養(yǎng)的上皮細(xì)胞胞飲突變異較大。透射電鏡（TEM）結(jié)果顯示，培養(yǎng)的上皮細(xì)胞具有極性，表面覆有微絨毛，較在位子宮內(nèi)膜細(xì)胞表面的微絨毛少。同時(shí)培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮也具有細(xì)胞間緊密連接和糖原沉積，與在體的子宮內(nèi)膜相似。 小結(jié) 建立的三維模型既含有上皮細(xì)胞，又包含基質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)。其生物學(xué)特征與在體的子宮內(nèi)膜基本相似，是一種較理想的體外模型。 二、 子宮內(nèi)膜體外重建 目的 用組織工程方法，利用新型的多孔聚合物支架材料膠原—聚乳酸羥基乙酸共聚物雜交聚合網(wǎng)（Collagen-PLGA polymer mesh）作為三維支架，將子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞作為種子細(xì)胞，探索建立人工子宮內(nèi)膜的可行性。 材料和方法 將分離純化的上皮細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞依次種植于生物可降解膠原—聚乳酸羥基乙酸共聚物雜交聚合網(wǎng)上下兩面，光鏡及掃描電鏡觀察細(xì)胞的生長狀況。 結(jié)果 子宮內(nèi)膜細(xì)胞可進(jìn)入聚合網(wǎng)內(nèi)部并粘附生長，24h后細(xì)胞粘附。掃描電鏡顯示在細(xì)胞培養(yǎng)第5天，細(xì)胞大量鋪展生長，有些區(qū)域，可見融合生長。培養(yǎng)第14天后，掃描電鏡見細(xì)胞融合成片，原膠原大部分已被子宮內(nèi)膜細(xì)胞分泌的細(xì)胞外基質(zhì)代替，形成三維結(jié)構(gòu)。 WP=7 小結(jié) 本實(shí)驗(yàn)首次應(yīng)用生物可降解的雜交聚合網(wǎng)作為支架在體外重建了子宮內(nèi)膜，提示用組織工程方法建立人工子宮內(nèi)膜的可行性。 第二部分 子宮內(nèi)膜容受性影響因素的研究 一、 胚胎與三維模型共培養(yǎng)及對(duì)子宮內(nèi)膜容受性的調(diào)節(jié) 目的 研究表明胚胎因素在誘導(dǎo)子宮容受性中具有重要作用，其具體機(jī)制還不清楚。本研究目的是將胚泡與建立的體外三維模型共培養(yǎng)，研究胚胎加入后，子宮內(nèi)膜細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化、胚胎與子宮內(nèi)膜相互作用的關(guān)系及對(duì)容受性標(biāo)志分子整合素β3的影響，探索胚胎因素對(duì)子宮容受性形成的調(diào)節(jié)作用。 材料和方法 給小鼠超排卵刺激后交配，將妊娠第4天的小鼠囊胚培養(yǎng)在已建立的體外子宮內(nèi)膜三維模型上，電鏡觀察胚胎植入時(shí)囊胚與子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。并用RT－PCR法測(cè)定子宮內(nèi)膜整合素β3基因水平的表達(dá)，Immunoblot法做整合素β3蛋白半定量測(cè)定。 結(jié)果 在三維模型中小鼠囊胚能正常脫透明帶、粘附和擴(kuò)展，小鼠囊胚24h、48h的脫帶率（31.3％、72.5％）、粘附率（16.7％、58.3％）與對(duì)照組單層子宮內(nèi)膜上皮（脫帶率：27.7％、70.8％，粘附率：15.3％、52.8％）相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）；體外模型中胚胎的48h擴(kuò)展率16.7％與對(duì)照組40.3％相比差異具顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。掃描電鏡顯示體外培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜可形成胞飲突，胚胎粘附于胞飲突上，胚胎表面覆有微絨毛。透射電鏡顯示培養(yǎng)的子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞具
【學(xué)位單位】：復(fù)旦大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2003
【中圖分類】：R321
【部分圖文】：

光鏡觀察消化出的上皮細(xì)胞呈團(tuán)塊狀結(jié)構(gòu)，其中混雜有少量的基質(zhì)細(xì)胞�；|(zhì)細(xì)胞呈單個(gè)細(xì)胞。見圖1-1-1,1-1-2。子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞分離后用 cytokeratin-18 和 desmin作為細(xì)胞表面標(biāo)志來鑒定子宮內(nèi)膜細(xì)胞的純度。免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，上皮細(xì)胞呈 Cytokeratin 18 陽性表達(dá)，Desmin 陰性�；|(zhì)細(xì)胞呈 Desmin 陽性表達(dá)，Cytokeratin 18 陰性。結(jié)果顯示用此方法分離的上皮細(xì)胞及基質(zhì)細(xì)胞純度達(dá) 90％。見圖 1-1-3, 1-1-4。

-2分離的子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，成單個(gè)細(xì)胞

-3子宮內(nèi)膜上皮細(xì)胞cytokeratin-18免疫組化染色,
【引證文獻(xiàn)】

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1 吳慶俠;豐艷妮;楚元奎;吳瑞;崔貞亮;靳亞平;;山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)及鑒定[J];西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版);2007年04期

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1 吳慶俠;山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞的分離培養(yǎng)[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2006年

2 盛宏霞;山羊子宮內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞分離培養(yǎng)及永生化的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2008年

3 屈延延;性腺激素對(duì)山羊子宮內(nèi)膜細(xì)胞分泌活性及激素受體表達(dá)的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2836396