福氏志賀氏菌是一類(lèi)具有高度傳染性的革蘭氏陰性桿菌,能夠侵入人的腸上皮細(xì)胞而引起細(xì)菌性痢疾。目前治療痢疾的主要方式是抗生素,但高達(dá)95%的臨床分離株對(duì)多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性;最佳手段是疫苗,但對(duì)其致病機(jī)理和宿主的免疫保護(hù)機(jī)制還不很清楚。而細(xì)菌毒力的表達(dá)并不是簡(jiǎn)簡(jiǎn)單單一個(gè)或幾個(gè)蛋白的作用,而是毒力大質(zhì)粒和染色體上眾多基因產(chǎn)物相互作用的一個(gè)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò),其中涉及到的蛋白必定會(huì)遠(yuǎn)超出我們已知的這些毒力相關(guān)因子。因此對(duì)志賀氏菌的基礎(chǔ)研究就顯得尤為重要,發(fā)現(xiàn)新的毒力相關(guān)蛋白,并明確它們的表達(dá)調(diào)控就成為我們工作的重點(diǎn)。 本實(shí)驗(yàn)室在志賀菌福氏2a 2457T野生株和驅(qū)除毒力大質(zhì)粒的突變株進(jìn)行30℃和37℃兩種溫度下比較蛋白質(zhì)組研究時(shí)發(fā)現(xiàn),某蛋白點(diǎn)的變化比較奇怪,于是本論文中首先采用窄梯度膠條對(duì)志賀菌福氏2a 2457T蛋白進(jìn)行雙向電泳分離,發(fā)現(xiàn)這個(gè)位置實(shí)際上對(duì)應(yīng)兩個(gè)蛋白點(diǎn),質(zhì)譜鑒定的結(jié)果是30℃表達(dá)上調(diào)的蛋白是ArgT,37℃表達(dá)上調(diào)的蛋白是PhoN2。其中PhoN2是毒力大質(zhì)粒編碼的一個(gè)毒力蛋白;而ArgT蛋白基因組注釋為賴(lài)氨酸、精氨酸和鳥(niǎo)氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,目前對(duì)于A(yíng)rgT這種溫度依賴(lài)的表達(dá)調(diào)控以及在志賀菌福氏2a 2457T中的功能還沒(méi)有報(bào)道。結(jié)合福氏志賀氏菌在37℃時(shí)發(fā)揮完整的細(xì)胞侵襲力,而在30℃時(shí)卻不能侵襲上皮細(xì)胞的現(xiàn)象,推測(cè)這個(gè)蛋白可能與志賀菌福氏2a 2457T的毒力有一定的相關(guān)性。 本文首先對(duì)ArgT溫度依賴(lài)的差異表達(dá)調(diào)控機(jī)理進(jìn)行了研究。通過(guò)半定量RT-PCR的方法確定ArgT的表達(dá)調(diào)控不在RNA水平;通過(guò)過(guò)表達(dá)載體強(qiáng)制表達(dá)ArgT的實(shí)驗(yàn)確定ArgT的表達(dá)調(diào)控發(fā)生在蛋白水平,是37℃時(shí)在翻譯后水平發(fā)生降解,而且這種降解不依賴(lài)于新蛋白的合成,是發(fā)生在周質(zhì)的間隙內(nèi)。另外,通過(guò)缺失突變體構(gòu)建和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)確定周間質(zhì)蛋白酶HtrA就是37℃時(shí)降解ArgT的關(guān)鍵蛋白酶;通過(guò)HtrA失活突變體構(gòu)建和體外生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)ArgT的降解是由HtrA直接單獨(dú)負(fù)責(zé)的,不需要其它蛋白的參與。蛋白酶HtrA30℃時(shí)不降解ArgT是因?yàn)榈陀?5℃時(shí)HtrA基本沒(méi)有蛋白酶活性。通過(guò)體外降解和質(zhì)譜鑒定相結(jié)合的方法確定了HtrA降解ArgT時(shí)的一個(gè)切割位點(diǎn),位于160位Val和161位Ala之間,和文獻(xiàn)報(bào)道的HtrA切割底物時(shí)其切割位點(diǎn)前一般是Val或Ile殘基是相符的。通過(guò)點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)ArgT 225位的Try突變?yōu)锳sp (大腸桿菌ArgT 225位對(duì)應(yīng)的氨基酸)后降解現(xiàn)象即不發(fā)生,推測(cè)225位時(shí)HtrA降解ArgT時(shí)的一個(gè)識(shí)別位點(diǎn),因?yàn)槲墨I(xiàn)報(bào)道HtrA在降解底物時(shí)其PDZ結(jié)構(gòu)域識(shí)別疏水的或者是芳香族的氨基酸殘基,而Try正是一個(gè)芳香族氨基酸。 接下來(lái)本文對(duì)ArgT蛋白對(duì)志賀菌福氏2a 2457T毒力的影響進(jìn)行了評(píng)價(jià)。我們知道,病原菌在從共同祖先進(jìn)化過(guò)程中涉及到毒力基因的獲得和抗毒力基因的失活,抗毒力基因在病原菌中不是必需的,強(qiáng)制表達(dá)它們還會(huì)使病原菌的毒力下降。2457T的argT基因在不發(fā)揮毒力的30℃時(shí)是正常表達(dá)的,而在發(fā)揮毒力的37℃時(shí)其表達(dá)產(chǎn)物被周間質(zhì)蛋白酶HtrA降解。另外,志賀菌福氏2a 2457T的ArgT和大腸桿菌DH5α的ArgT只有三個(gè)氨基酸的差別,在2457T中ArgT被降解,而在DH5α中ArgT是不被降解的。已知志賀菌福氏2a 2457T在30℃時(shí)沒(méi)有侵染毒力,而37℃時(shí)毒力表現(xiàn)正常;另外大腸桿菌是福氏志賀氏菌的非病原祖先,所有這些現(xiàn)象表明ArgT似乎和福氏志賀氏菌的毒力有一定聯(lián)系,很可能是一個(gè)抗毒力基因。由此本文構(gòu)建了志賀菌福氏2a 2457T的argT缺失的突變株和ArgT通過(guò)低拷貝質(zhì)粒過(guò)表達(dá)且不降解的突變株,通過(guò)突變株與野生株競(jìng)爭(zhēng)性侵襲HeLa細(xì)胞的毒力評(píng)價(jià)模型發(fā)現(xiàn),argT缺失株的毒力與野生株基本一致,而ArgT過(guò)表達(dá)株的毒力明顯比野生株減弱。另外,通過(guò)突變株與野生株競(jìng)爭(zhēng)性侵襲小鼠肺部細(xì)胞的毒力評(píng)價(jià)模型再次證實(shí),ArgT過(guò)表達(dá)株的毒力明顯比野生株減弱。這些實(shí)驗(yàn)表明argT應(yīng)該是福氏志賀氏菌中一個(gè)新的抗毒力基因,而且代表了一種新的模式,是通過(guò)蛋白降解而不是基因缺失或失活。 最后對(duì)ArgT的其它生物學(xué)功能進(jìn)行了探討。蛋白質(zhì)在細(xì)胞中并不是獨(dú)立地完成被賦予的功能,它們通常與其他蛋白質(zhì)相互作用形成大的復(fù)合體,在特定的時(shí)間和空間內(nèi)完成特定的功能。因此本文以GST-ArgT為誘餌蛋白,通過(guò)GST pull-down拽取2457T 37℃條件下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)晚期的全菌蛋白中和ArgT存在相互作用蛋白,然后進(jìn)行雙向電泳分離及質(zhì)譜鑒定,鑒定到兩個(gè)捕獲蛋白Cyp和OmpR。其中OmpR是雙組分(OmpR/ EnvZ)滲透壓感知調(diào)節(jié)系統(tǒng)的一部分,是一個(gè)毒力相關(guān)因子,可以調(diào)節(jié)vir基因和OmpF/C的表達(dá)。另外,基因的缺失和過(guò)表達(dá)在蛋白水平無(wú)疑也會(huì)影響與其功能相關(guān)的一些蛋白的表達(dá)。所以本文還對(duì)argT缺失和過(guò)表達(dá)的突變體的全菌蛋白與野生株的全菌蛋白進(jìn)行了的比較蛋白質(zhì)組研究。在全菌蛋白圖譜中共鑒定到了10個(gè)表達(dá)差異的蛋白點(diǎn),代表9種蛋白。其中在argT缺失株中表達(dá)上調(diào)的有2個(gè),表達(dá)下調(diào)的有3個(gè);在A(yíng)rgT過(guò)表達(dá)株中表達(dá)上調(diào)的有3個(gè),表達(dá)下調(diào)的有2個(gè)。 綜上所述,志賀菌福氏2a 2457T的ArgT蛋白在30℃和37℃兩種溫度下差異表達(dá)的調(diào)控機(jī)理是,在表現(xiàn)毒力的37℃時(shí)翻譯后的ArgT蛋白立即被周間質(zhì)蛋白酶HtrA降解;而不表現(xiàn)毒力的30℃時(shí)因?yàn)镠trA沒(méi)有蛋白酶活性,所以ArgT不被降解。在非病原宿主大腸桿菌中ArgT是表達(dá)的且行使正常的氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)功能;在病原宿主福氏志賀氏菌中ArgT發(fā)生了三個(gè)點(diǎn)突變,從而在37℃時(shí)被降解。而且經(jīng)細(xì)胞侵襲和小鼠肺部侵襲兩種毒力評(píng)價(jià)模型證實(shí),在志賀菌福氏2a 2457T中強(qiáng)制表達(dá)ArgT會(huì)使其侵襲毒力明顯減弱,推測(cè)argT應(yīng)該是一個(gè)抗毒力基因。另外,蛋白間相互作用和ArgT不同表達(dá)水平的比較蛋白質(zhì)組研究為綜合分析ArgT的生物學(xué)功能提供了參考。
【學(xué)位單位】：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2008
【中圖分類(lèi)】：R378
【部分圖文】：

. 志賀菌福氏 2a 2457T 在 30℃（圖 A）和 37℃（圖 B）全菌蛋白雙聚焦使用的 IPG 膠條梯度為 pH4.5-5.5；SDS-PAGE 電泳的凝膠濃度和結(jié)果查詢(xún)窄梯度雙向電泳圖譜我們發(fā)現(xiàn)，表達(dá)模式奇怪的蛋白白點(diǎn)，30℃左邊的蛋白表達(dá)上調(diào)，37℃右邊的蛋白點(diǎn)分別進(jìn)行膠內(nèi)酶切、質(zhì)譜鑒定。對(duì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)首先使的福式志賀氏菌 2a 2457T 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行肽質(zhì)量指紋e 網(wǎng)站（http://www.matrixscience.com）提供的 NCBI30℃表達(dá)上調(diào)的左邊蛋白是 ArgT，37℃表達(dá)上調(diào)的ArgT↘ ↙PhoN2B↙

圖 1-4. 蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的 Mascot 檢索結(jié)果A：30℃表達(dá)上調(diào)的左邊蛋白 ArgT Mascot 檢索結(jié)果；B：37℃表達(dá)上調(diào)的右邊蛋白 PhoN2 Mascot 檢索結(jié)果。討論采用 pH4.5-pH5.5 的窄梯度膠條對(duì)志賀菌福氏 2a 2457T 30℃和 3進(jìn)行雙向電泳分析，發(fā)現(xiàn)確實(shí)在膠圖上很好地分離了等電點(diǎn)在 4.，而且在朱力研究中那個(gè)表達(dá)模式奇怪的蛋白點(diǎn)也分離成為兩個(gè)獨(dú)鑒定的結(jié)果是：30℃表達(dá)上調(diào)的左邊蛋白是 ArgT，37℃表達(dá)上調(diào)N2。PhoN2 是志賀菌福氏 2a 2457T的毒力大質(zhì)粒編碼的一個(gè)毒力蛋白，腺苷雙磷酸酶活性。近來(lái)研究表明，PhoN2 是IcsA蛋白在菌體表面志賀氏菌在宿主細(xì)胞間擴(kuò)散所必需的，但PhoN2 與IcsA之間可能并作用[59]。既然PhoN2 是志賀菌福氏 2a 2457T的一個(gè)毒力蛋白，那

圖 2-1. pETKan 重組載體的構(gòu)建。打靶 DNA 的構(gòu)建福氏 2a 2457T 野生株為模版，采用全菌 PCR 的方法擴(kuò)增同源臂。同源臂 PCR 產(chǎn)物連接到 pMD18-T 載體，送交公司測(cè)序。測(cè)序正確后，分別使用上下游同源臂兩端引物上設(shè)計(jì)的相步連接到 pETkan 載體上。證正確后，用 BamHⅠ和 XhoⅠ雙酶切。經(jīng)膠回收試劑盒源臂為 500~600bp 的線(xiàn)性打靶 DNA。段為模板，PCR 擴(kuò)增出打靶基因，再次以膠回收試劑盒獲得濃度高達(dá) 300 ng/μl 線(xiàn)性打靶 DNA 片段。盒構(gòu)建的流程如下圖所示：
【引證文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前2條

1 史曼;類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞基因表達(dá)譜分析[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2010年

2 鄭子瑞;福氏志賀氏菌T3SS效應(yīng)分子IpaH4.5干擾宿主先天性免疫的研究[D];吉林大學(xué);2012年

本文編號(hào)：2836006