福氏志賀氏菌是一類具有高度傳染性的革蘭氏陰性桿菌,能夠侵入人的腸上皮細胞而引起細菌性痢疾。目前治療痢疾的主要方式是抗生素,但高達95%的臨床分離株對多種抗生素產(chǎn)生了耐藥性;最佳手段是疫苗,但對其致病機理和宿主的免疫保護機制還不很清楚。而細菌毒力的表達并不是簡簡單單一個或幾個蛋白的作用,而是毒力大質(zhì)粒和染色體上眾多基因產(chǎn)物相互作用的一個復雜網(wǎng)絡,其中涉及到的蛋白必定會遠超出我們已知的這些毒力相關(guān)因子。因此對志賀氏菌的基礎研究就顯得尤為重要,發(fā)現(xiàn)新的毒力相關(guān)蛋白,并明確它們的表達調(diào)控就成為我們工作的重點。 本實驗室在志賀菌福氏2a 2457T野生株和驅(qū)除毒力大質(zhì)粒的突變株進行30℃和37℃兩種溫度下比較蛋白質(zhì)組研究時發(fā)現(xiàn),某蛋白點的變化比較奇怪,于是本論文中首先采用窄梯度膠條對志賀菌福氏2a 2457T蛋白進行雙向電泳分離,發(fā)現(xiàn)這個位置實際上對應兩個蛋白點,質(zhì)譜鑒定的結(jié)果是30℃表達上調(diào)的蛋白是ArgT,37℃表達上調(diào)的蛋白是PhoN2。其中PhoN2是毒力大質(zhì)粒編碼的一個毒力蛋白;而ArgT蛋白基因組注釋為賴氨酸、精氨酸和鳥氨酸轉(zhuǎn)運蛋白,目前對于ArgT這種溫度依賴的表達調(diào)控以及在志賀菌福氏2a 2457T中的功能還沒有報道。結(jié)合福氏志賀氏菌在37℃時發(fā)揮完整的細胞侵襲力,而在30℃時卻不能侵襲上皮細胞的現(xiàn)象,推測這個蛋白可能與志賀菌福氏2a 2457T的毒力有一定的相關(guān)性。 本文首先對ArgT溫度依賴的差異表達調(diào)控機理進行了研究。通過半定量RT-PCR的方法確定ArgT的表達調(diào)控不在RNA水平;通過過表達載體強制表達ArgT的實驗確定ArgT的表達調(diào)控發(fā)生在蛋白水平,是37℃時在翻譯后水平發(fā)生降解,而且這種降解不依賴于新蛋白的合成,是發(fā)生在周質(zhì)的間隙內(nèi)。另外,通過缺失突變體構(gòu)建和體內(nèi)實驗確定周間質(zhì)蛋白酶HtrA就是37℃時降解ArgT的關(guān)鍵蛋白酶;通過HtrA失活突變體構(gòu)建和體外生化實驗證實ArgT的降解是由HtrA直接單獨負責的,不需要其它蛋白的參與。蛋白酶HtrA30℃時不降解ArgT是因為低于35℃時HtrA基本沒有蛋白酶活性。通過體外降解和質(zhì)譜鑒定相結(jié)合的方法確定了HtrA降解ArgT時的一個切割位點,位于160位Val和161位Ala之間,和文獻報道的HtrA切割底物時其切割位點前一般是Val或Ile殘基是相符的。通過點突變發(fā)現(xiàn)ArgT 225位的Try突變?yōu)锳sp (大腸桿菌ArgT 225位對應的氨基酸)后降解現(xiàn)象即不發(fā)生,推測225位時HtrA降解ArgT時的一個識別位點,因為文獻報道HtrA在降解底物時其PDZ結(jié)構(gòu)域識別疏水的或者是芳香族的氨基酸殘基,而Try正是一個芳香族氨基酸。 接下來本文對ArgT蛋白對志賀菌福氏2a 2457T毒力的影響進行了評價。我們知道,病原菌在從共同祖先進化過程中涉及到毒力基因的獲得和抗毒力基因的失活,抗毒力基因在病原菌中不是必需的,強制表達它們還會使病原菌的毒力下降。2457T的argT基因在不發(fā)揮毒力的30℃時是正常表達的,而在發(fā)揮毒力的37℃時其表達產(chǎn)物被周間質(zhì)蛋白酶HtrA降解。另外,志賀菌福氏2a 2457T的ArgT和大腸桿菌DH5α的ArgT只有三個氨基酸的差別,在2457T中ArgT被降解,而在DH5α中ArgT是不被降解的。已知志賀菌福氏2a 2457T在30℃時沒有侵染毒力,而37℃時毒力表現(xiàn)正常;另外大腸桿菌是福氏志賀氏菌的非病原祖先,所有這些現(xiàn)象表明ArgT似乎和福氏志賀氏菌的毒力有一定聯(lián)系,很可能是一個抗毒力基因。由此本文構(gòu)建了志賀菌福氏2a 2457T的argT缺失的突變株和ArgT通過低拷貝質(zhì)粒過表達且不降解的突變株,通過突變株與野生株競爭性侵襲HeLa細胞的毒力評價模型發(fā)現(xiàn),argT缺失株的毒力與野生株基本一致,而ArgT過表達株的毒力明顯比野生株減弱。另外,通過突變株與野生株競爭性侵襲小鼠肺部細胞的毒力評價模型再次證實,ArgT過表達株的毒力明顯比野生株減弱。這些實驗表明argT應該是福氏志賀氏菌中一個新的抗毒力基因,而且代表了一種新的模式,是通過蛋白降解而不是基因缺失或失活。 最后對ArgT的其它生物學功能進行了探討。蛋白質(zhì)在細胞中并不是獨立地完成被賦予的功能,它們通常與其他蛋白質(zhì)相互作用形成大的復合體,在特定的時間和空間內(nèi)完成特定的功能。因此本文以GST-ArgT為誘餌蛋白,通過GST pull-down拽取2457T 37℃條件下對數(shù)生長晚期的全菌蛋白中和ArgT存在相互作用蛋白,然后進行雙向電泳分離及質(zhì)譜鑒定,鑒定到兩個捕獲蛋白Cyp和OmpR。其中OmpR是雙組分(OmpR/ EnvZ)滲透壓感知調(diào)節(jié)系統(tǒng)的一部分,是一個毒力相關(guān)因子,可以調(diào)節(jié)vir基因和OmpF/C的表達。另外,基因的缺失和過表達在蛋白水平無疑也會影響與其功能相關(guān)的一些蛋白的表達。所以本文還對argT缺失和過表達的突變體的全菌蛋白與野生株的全菌蛋白進行了的比較蛋白質(zhì)組研究。在全菌蛋白圖譜中共鑒定到了10個表達差異的蛋白點,代表9種蛋白。其中在argT缺失株中表達上調(diào)的有2個,表達下調(diào)的有3個;在ArgT過表達株中表達上調(diào)的有3個,表達下調(diào)的有2個。 綜上所述,志賀菌福氏2a 2457T的ArgT蛋白在30℃和37℃兩種溫度下差異表達的調(diào)控機理是,在表現(xiàn)毒力的37℃時翻譯后的ArgT蛋白立即被周間質(zhì)蛋白酶HtrA降解;而不表現(xiàn)毒力的30℃時因為HtrA沒有蛋白酶活性,所以ArgT不被降解。在非病原宿主大腸桿菌中ArgT是表達的且行使正常的氨基酸轉(zhuǎn)運功能;在病原宿主福氏志賀氏菌中ArgT發(fā)生了三個點突變,從而在37℃時被降解。而且經(jīng)細胞侵襲和小鼠肺部侵襲兩種毒力評價模型證實,在志賀菌福氏2a 2457T中強制表達ArgT會使其侵襲毒力明顯減弱,推測argT應該是一個抗毒力基因。另外,蛋白間相互作用和ArgT不同表達水平的比較蛋白質(zhì)組研究為綜合分析ArgT的生物學功能提供了參考。
【學位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院
【學位級別】：博士
【學位年份】：2008
【中圖分類】：R378
【部分圖文】：

. 志賀菌福氏 2a 2457T 在 30℃（圖 A）和 37℃（圖 B）全菌蛋白雙聚焦使用的 IPG 膠條梯度為 pH4.5-5.5；SDS-PAGE 電泳的凝膠濃度和結(jié)果查詢窄梯度雙向電泳圖譜我們發(fā)現(xiàn)，表達模式奇怪的蛋白白點，30℃左邊的蛋白表達上調(diào)，37℃右邊的蛋白點分別進行膠內(nèi)酶切、質(zhì)譜鑒定。對質(zhì)譜數(shù)據(jù)首先使的福式志賀氏菌 2a 2457T 數(shù)據(jù)庫進行肽質(zhì)量指紋e 網(wǎng)站（http://www.matrixscience.com）提供的 NCBI30℃表達上調(diào)的左邊蛋白是 ArgT，37℃表達上調(diào)的ArgT↘ ↙PhoN2B↙

圖 1-4. 蛋白的質(zhì)譜數(shù)據(jù)的 Mascot 檢索結(jié)果A：30℃表達上調(diào)的左邊蛋白 ArgT Mascot 檢索結(jié)果；B：37℃表達上調(diào)的右邊蛋白 PhoN2 Mascot 檢索結(jié)果。討論采用 pH4.5-pH5.5 的窄梯度膠條對志賀菌福氏 2a 2457T 30℃和 3進行雙向電泳分析，發(fā)現(xiàn)確實在膠圖上很好地分離了等電點在 4.，而且在朱力研究中那個表達模式奇怪的蛋白點也分離成為兩個獨鑒定的結(jié)果是：30℃表達上調(diào)的左邊蛋白是 ArgT，37℃表達上調(diào)N2。PhoN2 是志賀菌福氏 2a 2457T的毒力大質(zhì)粒編碼的一個毒力蛋白，腺苷雙磷酸酶活性。近來研究表明，PhoN2 是IcsA蛋白在菌體表面志賀氏菌在宿主細胞間擴散所必需的，但PhoN2 與IcsA之間可能并作用[59]。既然PhoN2 是志賀菌福氏 2a 2457T的一個毒力蛋白，那

圖 2-1. pETKan 重組載體的構(gòu)建。打靶 DNA 的構(gòu)建福氏 2a 2457T 野生株為模版，采用全菌 PCR 的方法擴增同源臂。同源臂 PCR 產(chǎn)物連接到 pMD18-T 載體，送交公司測序。測序正確后，分別使用上下游同源臂兩端引物上設計的相步連接到 pETkan 載體上。證正確后，用 BamHⅠ和 XhoⅠ雙酶切。經(jīng)膠回收試劑盒源臂為 500~600bp 的線性打靶 DNA。段為模板，PCR 擴增出打靶基因，再次以膠回收試劑盒獲得濃度高達 300 ng/μl 線性打靶 DNA 片段。盒構(gòu)建的流程如下圖所示：
【引證文獻】

相關(guān)博士學位論文 前2條

1 史曼;類風濕性關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)滑膜細胞基因表達譜分析[D];第四軍醫(yī)大學;2010年

2 鄭子瑞;福氏志賀氏菌T3SS效應分子IpaH4.5干擾宿主先天性免疫的研究[D];吉林大學;2012年

本文編號：2836006