周圍血管疾病一直嚴(yán)重危害著人類健康，目前尚無(wú)非常有效的治療方法。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells, EPCs)的發(fā)現(xiàn)開辟了一條新的治療途徑。EPCs是成熟血管內(nèi)皮細(xì)胞的前體細(xì)胞，既可不斷增殖，又能定向分化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，在血管生成中具有多種功能。載脂蛋白(a)[(apolipoprotein(a)，apo(a)]是脂蛋白(a)[lipoprotein(a)，Lp(a)]重要組成成分，也是周圍血管疾病獨(dú)立危險(xiǎn)因子。有文獻(xiàn)報(bào)道了Lp(a)對(duì)EPCs生物學(xué)功能的影響，但有關(guān)Lp(a)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞及EPCs的增殖、分化作用，仍存在兩種截然對(duì)立的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。血清Lp(a)水平不受環(huán)境、飲食和藥物的影響，而apo(a)的合成情況可影響著Lp(a)血清濃度，并且apo(a)還可獨(dú)立于apoB-100或Lp(a)而單獨(dú)影響血管病理生理功能。但apo(a)影響EPCs血管生成及其機(jī)制尚不清楚。 本研究從小鼠骨髓分離培養(yǎng)EPCs，觀察apo(a)對(duì)EPCs體內(nèi)外血管生成能力的影響，并探討了其機(jī)制。主要研究結(jié)果及方法如下： 第一部分Apo(a)對(duì)小鼠骨髓源性EPCs血管生成能力的影響 目的：研究apo(a)對(duì)小鼠骨髓源性EPCs遷移、粘附、歸巢及血管生成能力的影響。 方法：從小鼠骨髓分離、培養(yǎng)、鑒定EPCs，觀察apo(a)對(duì)EPCs粘附、遷移及matrigel膠上血管腔樣結(jié)構(gòu)的影響；復(fù)制小鼠下肢缺血模型，3×10~5EPCs移植下肢缺血實(shí)驗(yàn)小鼠，于移植后第3、7、14天取小鼠腓腸肌，檢測(cè)缺血組織EPCs歸巢數(shù)量及毛細(xì)血管密度；RT-PCR、western blot檢測(cè)P/E selectin、PGSL-1、CXCR4、VEGF表達(dá)。 結(jié)果：小鼠骨髓源性EPCs可吞噬Dil-AcLDL并結(jié)合UEA-1，原代EPCs細(xì)胞表面標(biāo)志CD133+/VEGFR-2+、CD34+/VEGFR-2+、vWF分別為72.2%、71.26%和1.0%。Apo(a)呈劑量依賴性抑制EPCs粘附能力：加入0.2μg/ml apo(a),與對(duì)照組相比，粘附率減少94.2%(P0.01)，加入15μg/ml apo(a), EPCs幾乎完全凋亡，體外遷移實(shí)驗(yàn)也取得了相似結(jié)果。Mtrigel膠上，10μg/ml apo(a)時(shí)，野生型鼠EPCs及轉(zhuǎn)基因鼠EPCs血管腔樣結(jié)構(gòu)被破壞92.1%(P0.01)。RT-PCR及western blot檢測(cè)到缺血組織血管內(nèi)皮表達(dá)P/E selectin，VEGF在缺血組織表達(dá)升高，而PGSL-1、CXCR4在apo(a)處理的EPCs表達(dá)降低；動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，對(duì)照鼠缺血組織血管周圍可見EPCs募集，而轉(zhuǎn)apo(a)基因鼠不但EPCs歸巢數(shù)量顯著減少(P0.05)，毛細(xì)血管生成數(shù)量也顯著減少(P0.05)。 結(jié)論：apo(a)可抑制EPCs粘附、遷移、歸巢及血管生成能力。 第二部分Apo(a)影響EPCs血管生成能力的機(jī)制研究 目的：探討apo(a)抑制EPCs血管生成的機(jī)制。 方法：收集培養(yǎng)的EPCs，提取總RNA, RT-PCR檢測(cè)Notch受體、配基及LOX-1表達(dá)；分析apo(a)影響它們表達(dá)的最大時(shí)效、量效關(guān)系；免疫共沉淀檢測(cè)apo(a)對(duì)Notch受體、配基結(jié)合的影響，RT-PCR檢測(cè)下游基因表達(dá)。 結(jié)果：小鼠骨髓源性EPCs只檢測(cè)到Notch2受體和JAG-1、JAG-2配基表達(dá)，而且在10μg/ml apo(a)處理24小時(shí)表達(dá)最高；apo(a)促進(jìn)Notch2與JAG-1配基結(jié)合，RBPJ、HES、HEY的mRNA表達(dá)量分別增加30%、27%及22%(P0.05)，CXCR4、PGSL-1蛋白表達(dá)量分別降低72%與80%(P0.05)，但VEGF表達(dá)無(wú)顯著變化。封閉LOX-1受體后，免疫共沉淀檢測(cè)不到Notch2受體與JAG-1配基結(jié)合，CXCR4、PGSL-1、VEGF表達(dá)與LOX-1封閉前相比，無(wú)顯著差異。 結(jié)論：apo(a)促進(jìn)Notch受體配基結(jié)合,上調(diào)RBPJ、HES、HEY表達(dá)，降低CXCR4、PGSL-1表達(dá)，抑制EPCs的粘附、遷移、歸巢及血管生成能力；LOX-1參與了apo(a)對(duì)EPCs血管生成的影響。
【學(xué)位單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R363
【部分圖文】：

實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.小鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞分離與誘導(dǎo)培養(yǎng)收集沖洗后的全骨髓細(xì)胞，經(jīng) 1800rpm、20min 離心后，小心吸取經(jīng)密度梯度離心分離的中間云霧狀單個(gè)核細(xì)胞，于 0.1%明膠包被的培養(yǎng)瓶中 5ml 含 VEGF 的 M199 誘導(dǎo)培養(yǎng)，半小時(shí)后細(xì)胞即開始貼壁，24 小時(shí)后觀察，少數(shù)貼壁細(xì)胞開始變形，3 天左右即長(zhǎng)出長(zhǎng)梭形的細(xì)胞，隨后呈漩渦狀生長(zhǎng)逐漸融合培養(yǎng)瓶，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞增殖減慢，6-7 天左右細(xì)胞增殖停止，此后進(jìn)行傳代培養(yǎng)，但這種細(xì)胞傳代能力差，傳 2 代左右，細(xì)胞形態(tài)開始變形，出現(xiàn)楓葉狀或竹葉狀形態(tài)，細(xì)胞表面標(biāo)志也發(fā)生改變，為早期 EPCs(early EPCs) （圖 1-1，圖 1-2）；BA

圖 1-2 傳代培養(yǎng)的早期 EPCsA：傳代的早期 EPCs（P1 代）(20×)； B：細(xì)胞形狀變得不規(guī)則，呈楓葉或竹葉狀（P3代）(40×)。分離后的單個(gè)核細(xì)胞于貼壁培養(yǎng) 24 小時(shí)后，吸取懸浮的未貼壁細(xì)胞，種植于另一明膠過夜包被的培養(yǎng)瓶，進(jìn)行二次貼壁培養(yǎng)。二次貼壁的細(xì)胞于貼壁后呈短梭形或橢圓形，6-7 天細(xì)胞停止增殖，此時(shí)不要收獲細(xì)胞，繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)，大約 2 周左右即可出現(xiàn)集落，胞體較大，典型細(xì)胞集落形成，血島樣，周圍細(xì)胞呈放射狀生長(zhǎng)，這些呈集落樣生長(zhǎng)的細(xì)胞即是小鼠骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞集落逐漸增大，細(xì)胞增殖加快，3 周左右即可呈鋪路石樣融合整個(gè)培養(yǎng)瓶，此時(shí)按 1：2 傳代培養(yǎng)（圖 1-3）。這種鋪路石樣生長(zhǎng)細(xì)胞，性

23圖 1-3 晚期 EPCs 原代培養(yǎng) （第二次貼壁）（20×）A：第 1 天，可見貼壁細(xì)胞；B：貼壁后第 3 天，第一次換液，細(xì)胞開始增殖，呈集落趨勢(shì)生長(zhǎng)；C：第 15 天左右可見明顯的細(xì)胞集落；D：放大的單個(gè)細(xì)胞集落，集落中間細(xì)胞集聚，周圍細(xì)胞放射狀向四周生長(zhǎng)（40×）；E：細(xì)胞集落不斷增殖擴(kuò)大，逐漸向四周融合；F：第 20 天左右，眾多集落增殖融合整個(gè)培養(yǎng)瓶。
【參考文獻(xiàn)】

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1 駱志清;王毅;羅志剛;;Notch信號(hào)通路在誘導(dǎo)免疫耐受作用中的研究進(jìn)展[J];臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2008年01期

2 蔡文杰;王銘潔;朱依純;;下肢缺血模型中微循環(huán)功能研究方法的建立[J];中國(guó)藥理學(xué)通報(bào);2010年05期

本文編號(hào)：2835804