發(fā)布時間：2020-10-10 20:21

　　 第一部分 獼猴胚胎源性神經干細胞的誘導分化、干性維持及腦內移植 目的：建立穩(wěn)定高效的獼猴神經干細胞體外培養(yǎng)、誘導體系,使其可成功的分化及特性維持；觀察研究獼猴神經干細胞同種腦內移植后的轉歸,進一步驗證獼猴神經干細胞經體外培養(yǎng)、誘導后的特性及可應用性,為神經干細胞臨床應用研究。 方法：1)以綠色熒光蛋白(Green fluorescence protein, GFP)為標記,探討獼猴胚胎干細胞向玫瑰花環(huán)(Rosettes)結構神經干細胞的分化及其堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)和表皮生長因子(Epidermal growth factor, EGF)的擴增培養(yǎng)；2)經立體定位,利用微量注射器,將5ul(1X105個/u1)神經干細胞移植到獼猴海馬區(qū),移植后2個月后,取腦組織冰凍切片,用免疫組織化學和激光共聚焦鑒定移植的神經干細胞在體內的存活與分化情況。 結果：1)建立了穩(wěn)定高效的獼猴神經干細胞分化體系；2)分化得到的Rosettes結構神經干細胞經bFGF/EGF擴增后,能夠較好的維持其Rosettes結構；3)神經干細胞移植到兩只獼猴腦內后兩個月,發(fā)現移植細胞能夠較好的存活,并向神經元及神經膠質細胞分化。 結論：經bFGF/EGF擴增培養(yǎng)獼猴胚胎干細胞能較好的維持神經干細胞的Rosettes結構(真正意義上的早期全能神經前體細胞)；擴增培養(yǎng)的神經干細胞移植到兩只獼猴腦內后能維持其特性,為將來神經干細胞應用于臨床提供基礎理論依據。 第二部分 神經干細胞移植對腦外傷大鼠神經功能恢復、細胞凋亡及凋亡基因表達的影響 目的：觀察神經干細胞(NSCs)移植對腦損傷大鼠神經功能及細胞凋亡的影響,探討其分子機制。 方法：24只SD大鼠隨機分為3組：假手術組、手術組和NSCs移植組。采用自由落體致大鼠皮質運動區(qū)腦損傷模型,NSCs于術后當天移植入腦損傷大鼠挫傷位周圍4個點；術后觀察大鼠的神經功能恢復情況,移植的NSCs在腦組織存活、遷移及細胞凋亡、抗凋亡基因表達情況。 結果：NSCs移植后NSS評分至第7天明顯比對照組下降,說明NSC移植對腦外傷大鼠神經功能有改善作用。移植NSCs能在宿主腦組織存活,并向四周遷移；凋亡細胞數量明顯減少；而抗凋亡基因BCL-XL表達明顯增加,與未移植NSCs的單純手術組比較差異均有統計學意義。 結論：NSCs能改善腦損傷大鼠神經功能,其機制可能與NSCs在體內存活、能夠減少細胞凋亡和增加抗凋亡基因BCL-XL表達有關。 第三部分 適用神經干細胞移植研究的青光眼視神經損傷模型的建立 目的：探索一種能夠適用于干細胞移植研究的青光眼造模方法,為神經干細胞臨床應用研究奠定模型基礎。 方法：本實驗采用對新西蘭白兔球結膜下注射地塞米松注射液的方式給藥,2.5mg/次,一周3次(間隔一天給藥),持續(xù)8周。 結果：眼底照相觀察到造模眼眼球屈光間質保持清晰,視乳頭凹陷明顯擴大、血管呈屈膝狀；病理切片顯示造模眼視神經受到明顯損傷；海德堡視網膜斷層掃描儀(Heidelberg Retina Tomography, HRT)定量分析顯示造模眼呈現盤沿面積減小1.10±0.88mm2、杯/盤比增大0.17±0.13,以及視網膜神經纖維層平均厚度降低0.44±0.31mm的青光眼性質病理改變,均達到極顯著水平(p0.001)。 結論：1)本實驗建立了一種簡單可靠、重復性強的慢性青光眼視神經損傷的造模方法；2)造模眼眼壓波動輕微,不會影響移植細胞的生長,眼底照相觀察到造模眼眼球屈光間質保持清晰,適合觀察神經干細胞移植后情況,此造模方法適用于干細胞移植研究。 第四部分兔青光眼視神經損傷后移植神經干細胞的探索研究 目的：探索青光眼視神經損傷后移植神經干細胞具體可行性。 方法：青光眼視神經損傷模型建立后,以不同的移植方法雙眼(模型眼及對照眼)注入獼猴神經干細胞,植入5個月后,摘取眼球,采用不同標本制作方法,固定、切片,通過共聚焦顯微鏡觀察神經干細胞生長存活情況,并觀察其在眼內遷移及與視網膜整合情況,移植后眼內反應等。 結果：青光眼視神經損傷兔眼(模型眼)玻璃體內可見存活的神經干細胞,未見神經干細胞遷移及與視網膜整合,對照眼未見神經干細胞存活；此結果與移植方法、標本制作方法及免疫反應有關。 結論：獼猴神經干細胞能夠在青光眼視神經損傷的兔眼玻璃體內長時間存活并生長,為后續(xù)研究奠定了基礎,進一步證實了本實驗第三部分的造模方法適合用于神經干細胞移植的研究；神經干細胞玻璃體移植后未見向視網膜遷移整合,提示對神經干細胞眼內注入方法需進一步改良研究；僅在模型眼(注射地塞米松)觀察到神經干細胞玻璃體存活生長,對照眼未見,且有眼內反應現象,為下一步研究神經干細胞眼內移植后如何控制免疫排斥反應提供了思路。 第五部分 單側青光眼視神經損傷后眼外肌及其本體感受器病理學改變 目的研究單側青光眼視神經損傷后間歇性斜視(知覺性)患者眼外肌及其本體感受器的超微結構,以期了解青光眼視神經損傷患者眼運動系統的病理變化及探討其發(fā)病機制,推進對青光眼神經疾病的認識,并為后續(xù)研究神經干細胞移植提供組織形態(tài)學基礎。 方法選取10例單側青光眼視神經損傷后間歇性(知覺性)外斜視患者非注視眼內直肌附著點后長約4-5mm,寬約1Omm的眼外肌作為實驗組(光鏡10例、透射電鏡10例),選取10例同期角膜移植供體的健康人眼內直肌作為正常對照組(光鏡5例、透射電鏡5例),制作病理標本,光鏡及透射電鏡下觀察比較2組肌纖維及眼外肌本體感受器的超微結構差異。 結果同正常對照組比較,單側青光眼視神經損傷后間歇性(知覺性)外斜視患者眼外肌纖維排列紊亂,部分纖維萎縮、水腫,線粒體變性,眼外肌本體感受器結構出現明顯異常,內外膜不完整,梭內肌纖維排列紊亂,有髓神經軸漿內有殘體形成,線粒體缺如,內膜與Schwann細胞間可見粗大致密的膠原纖維增生,神經纖維內微絲、微管等細胞器減少,嚴重者可見有髓神經脫髓鞘。 結論單側青光眼視神經損傷后眼外肌內直肌及其本體感受器發(fā)生了病理性改變,即眼運動神經通路的效應器出現了異常改變。
【學位單位】：昆明醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R329
【文章目錄】：
中文摘要
Abstract
中英文縮寫詞表
研究背景
    參考文獻
第一部分 獼猴胚胎源性神經干細胞的誘導分化、干性維持及腦內移植
    引言
    材料及方法
    結果
    討論
    結論
    參考文獻
第二部分 神經干細胞移植對腦外傷大鼠神經功能恢復、細胞凋亡及凋亡基因表達的影響
    引言
    材料及方法
    結果
    討論
    結論
    參考文獻
第三部分 適用神經干細胞移植研究的青光眼視神經損傷模型的建立
    引言
    材料方法
    結果
    討論
    參考文獻
第四部分 兔青光眼視神經損傷后移植神經干細胞的探索研究
    引言
    材料及方法
    結果
    討論
    參考文獻
第五部分 單側青光眼視神經損傷后眼外肌及其本體感受器病理學改變
    引言
    材料及方法
    結果
    討論
    參考文獻
結論
本課題的創(chuàng)新點及其意義
綜述
    參考文獻
博士在讀期間發(fā)表論文
致謝

【參考文獻】

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本文編號：2835539