Cell-in-cell是指一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞進(jìn)到另一個(gè)細(xì)胞的胞漿內(nèi)，形成細(xì)胞套疊結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象。Cell-in-cell可以分為兩大類，一類是同種的cell-in-cell（即homotypiccell-in-cell），是指發(fā)生在同種細(xì)胞之間的細(xì)胞進(jìn)出，另一類是異種的cell-in-cell（即heterotypic cell-in-cell），是指不同種類的細(xì)胞之間的細(xì)胞進(jìn)出。本論文研究的是發(fā)生在淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞以及正常細(xì)胞之間的heterotypic cell-in-cell。 我們通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)：NK92MI、T細(xì)胞、B細(xì)胞，甚至粒細(xì)胞和單核細(xì)胞，均可以鉆入腫瘤細(xì)胞，甚至正常的細(xì)胞中，包括分化程度低的干細(xì)胞形成典型的heterotypic cell-in-cell結(jié)構(gòu)。這種現(xiàn)象可以跨種系存在，小鼠LAK細(xì)胞可以鉆入人的表皮癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞中，人的NK細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和B淋巴細(xì)胞亦可以鉆入老鼠的黑色素瘤細(xì)胞，甚至正常的小鼠成纖維細(xì)胞中以及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。提示heterotypic cell-in-cell是一個(gè)很原始的現(xiàn)象，有可能在生物進(jìn)化過(guò)程中起著極為重要的作用。 在體內(nèi)我們閱讀了多種癌癥患者的病理標(biāo)本發(fā)現(xiàn)癌巢部位比癌旁部位有更多的heterotypic cell-in-cell結(jié)構(gòu)，同時(shí)在小鼠肝炎模型中發(fā)現(xiàn)相對(duì)于正常小鼠，藥物誘導(dǎo)肝損傷的小鼠肝臟中可見更多的淋巴細(xì)胞進(jìn)入肝臟細(xì)胞形成heterotypiccell-in-cell結(jié)構(gòu)。 在體外淋巴細(xì)胞進(jìn)入腫瘤細(xì)胞形成heterotypic cell-in-cell結(jié)構(gòu)后的命運(yùn)是多樣化的。大部分淋巴細(xì)胞進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后會(huì)死亡，被腫瘤細(xì)胞消化吸收或者排出胞外，小部分淋巴細(xì)胞會(huì)逃逸出來(lái)，其表面的受體或基因型是否變化有待進(jìn)一步研究，小部分淋巴細(xì)胞會(huì)在腫瘤細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行有絲分裂，比較有意思的是，部分淋巴細(xì)胞還可以攻擊并鉆入宿主細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)。 Cell-in-cell的生物學(xué)意義不是很清楚，我們的研究發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞進(jìn)入腫瘤細(xì)胞中，會(huì)影響靶細(xì)胞有絲分裂后期卵裂溝的形成，導(dǎo)致靶細(xì)胞異倍體或者多核的形成。同時(shí)在體內(nèi)的腫瘤芯片中亦觀察到該現(xiàn)象。這一發(fā)現(xiàn)揭示了heterotypiccell-in-cell很有可能在腫瘤的形成及惡化過(guò)程中起著重要的作用。 病毒的感染都是有細(xì)胞選擇性的，例如EBV病毒更容易感染CD21陽(yáng)性的B淋巴細(xì)胞，HIV病毒則易感染CD4陽(yáng)性的T淋巴細(xì)胞，但也有報(bào)道體內(nèi)病毒感染本身不表達(dá)受體的細(xì)胞，其感染途徑一直都不是很清楚。本論文探討heterotypic cell-in-cell是否介導(dǎo)了病毒感染非易感細(xì)胞，我們將帶有GFP報(bào)告基因的重組EBV病毒感染的人B細(xì)胞細(xì)胞株Akata同不表達(dá)CD21受體的多種非病毒易感上皮細(xì)胞共同撫育，觀察到Akata可以鉆入上皮細(xì)胞內(nèi)并將病毒攜帶進(jìn)入上皮細(xì)胞并通過(guò)檢測(cè)EBNA1抗原的表達(dá)確認(rèn)上皮細(xì)胞成功感染EBV病毒。將HIV陽(yáng)性的H9/IIIB細(xì)胞與CD4陰性的上皮細(xì)胞共同培養(yǎng)進(jìn)一步證明了這種全新的胞內(nèi)病毒感染方式。利用流式細(xì)胞術(shù)分離、富集heterotypic cell-in-cell結(jié)構(gòu)，繼續(xù)培養(yǎng)并用G418篩選，于7天后出現(xiàn)GFP陽(yáng)性的CNE-2細(xì)胞，并通過(guò)免疫熒光及透射電鏡等技術(shù)手段證明發(fā)生cell-in-cell的CNE-2細(xì)胞最終感染了EBV。rEBV可以通過(guò)感染的宿主細(xì)胞Akata經(jīng)cell-in-cell過(guò)程將病毒帶入CNE-2細(xì)胞內(nèi)，并通過(guò)細(xì)胞裂解等途徑活化和釋放rEBV至靶細(xì)胞胞漿內(nèi)，從而產(chǎn)生綠色熒光，釋放的病毒可以進(jìn)一步通過(guò)病毒已知機(jī)制進(jìn)入病毒循環(huán)生活周期，在CNE-2內(nèi)建立持續(xù)感染并繼續(xù)通過(guò)核融合或基因交換等新機(jī)制整合于靶細(xì)胞基因組中。Cell-in-cell介導(dǎo)被感染的CNE-2細(xì)胞的生物學(xué)特征發(fā)生顯著變化，除了表達(dá)病毒抗原以外，同時(shí)出現(xiàn)染色體不穩(wěn)定，極易被誘導(dǎo)成為癌細(xì)胞，并且可繼續(xù)作為一個(gè)新生病毒源，繼續(xù)通過(guò)包裝釋放裸病毒粒子或cell to cell途徑繼續(xù)感染鄰近細(xì)胞，形成感染島。
【學(xué)位單位】：華南理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R363;Q24
【文章目錄】：
摘要
Abstract
中英文對(duì)照和縮略詞表
第一章 緒論
    1.1. Cell-in-cell 結(jié)構(gòu)的研究
        1.1.1 Cell-in-cell 現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn)和歷史
        1.1.2 cell-in-cell 的分類
        1.1.3 cell-in-cell 的生物學(xué)意義
    1.2. Heterotypic cell-in-cell 與炎癥、癌癥
        1.2.2 Heterotypic cell-in-cell 與炎癥
        1.2.3 Heterotypic cell-in-cell 與癌癥
    1.3. Heterotypic cell-in-cell 與染色體不穩(wěn)定性
        1.3.1 染色體不穩(wěn)定性的定義與特征
        1.3.2 染色體不穩(wěn)定性的形成原因
    1.4. Heterotypic cell-in-cell 與病毒感染及傳播
        1.4.1 裸病毒（cell free）感染
        1.4.2 細(xì)胞接觸（cell to cell）感染
    1.5. 本課題的目的意義與研究?jī)?nèi)容
        1.5.1 目的意義
        1.5.2 研究?jī)?nèi)容
第二章 體外 heterotypic cell-in-cell 結(jié)構(gòu)的研究
    2.1. 前言
    2.2. 材料與方法
        2.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        2.2.2 Heterotypic cell-in-cell 反應(yīng)體系的建立
        2.2.3 Heterotypic cell-in-cell Index 的統(tǒng)計(jì)
        2.2.4 Giemsa 染色方法
        2.2.5 Heterotypic cell-in-cell 的獲得與富集
        2.2.6 Heterotypic cell-in-cell 結(jié)構(gòu)中多核細(xì)胞的統(tǒng)計(jì)
        2.2.7 熒光原位雜交
        2.2.8 流式細(xì)胞儀檢測(cè) DNA 含量
        2.2.9 透射電鏡標(biāo)本制備
        2.2.10 活細(xì)胞工作站觀察及追蹤 heterotypic cell-in-cell
        2.2.11 小鼠脾臟 LAK 細(xì)胞的分離
        2.2.12 Transwell 的方法檢測(cè)細(xì)胞的遷移率
    2.3. 結(jié)果與討論
        2.3.1 Heterotypic cell-in-cell 的形態(tài)學(xué)及動(dòng)力學(xué)特征
        2.3.2 Heterotypic cell-in-cell 普遍存在于淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間
        2.3.3 Heterotypic cell-in-cell 可形成于淋巴細(xì)胞與正常細(xì)胞之間
        2.3.4 Heterotypic cell-in-cell 可形成于不同腫瘤細(xì)胞之間
        2.3.5 Heterotypic cell-in-cell 結(jié)構(gòu)中的效應(yīng)細(xì)胞的命運(yùn)具有多樣性
        2.3.6 Heterotypic cell-in-cell 結(jié)構(gòu)中的宿主細(xì)胞的命運(yùn)具有多樣性
        2.3.7 Heterotypic cell-in-cell 結(jié)構(gòu)中的宿主細(xì)胞大部分是多核細(xì)胞
        2.3.8 Heterotypic cell-in-cell 可導(dǎo)致細(xì)胞融合的發(fā)生
    2.4 本章小結(jié)
第三章 體內(nèi) heterotypic cell-in-cell 結(jié)構(gòu)與炎癥、癌癥相關(guān)機(jī)制的研究
    3.1. 前言
    3.2. 材料與方法
        3.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        3.2.2 小鼠 ConA 誘導(dǎo)肝損傷模型的建立
        3.2.3 小鼠 PolyI:C 誘導(dǎo)肝損傷模型的建立
        3.2.4 GVHD 老鼠模型的建立
        3.2.5 組織標(biāo)本的處理及 HE 染色
        3.2.6 透射電鏡標(biāo)本的制作
        3.2.7 Heterotypic cell-in-cell 的統(tǒng)計(jì)
    3.3. 結(jié)果與討論
        3.3.1 臨床肝炎、腎炎標(biāo)本中普遍存在 heterotypic cell-in-cell 結(jié)構(gòu)
        3.3.2 炎癥的誘發(fā)提高了 heterotypic cell-in-cell 結(jié)構(gòu)的發(fā)生
        3.3.3 藥物誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因鼠肝損傷可見更多的 heterotypic cell-in-cell 結(jié)構(gòu)
        3.3.4 GVHD 小鼠的肝臟、皮膚、大腸及小腸組織中普遍存在 heterotypic cell-in-cell 結(jié)構(gòu)
        3.3.5 癌癥患者的標(biāo)本中普遍存在 heterotypic cell-in-cell 結(jié)構(gòu)
    3.4. 本章小結(jié)
第四章 Heterotypic cell-in-cell 是介導(dǎo)病毒感染非易感細(xì)胞的途徑之一
    4.1. 前言
    4.2. 材料與方法
        4.2.1 實(shí)驗(yàn)材料
        4.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)方法
        4.2.3 組織標(biāo)本處理及 HE 染色
        4.2.4 免疫組化
        4.2.5 細(xì)胞鉆入實(shí)驗(yàn)
        4.2.6 In cell infection CNE-2 細(xì)胞的建立
        4.2.7 免疫熒光
        4.2.8 Western Blot
        4.2.9 RT-PCR
        4.2.10 病毒的獲得
        4.2.11 病毒拷貝數(shù)的檢測(cè)
        4.2.12 流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染率
        4.2.13 透射電鏡標(biāo)本的制作
    4.3. 結(jié)果與討論
        4.3.1 艾滋病感染者腸道部位和鼻咽癌患者的鼻咽部位普遍存在heterotypic cell-in-cell 結(jié)構(gòu)
        4.3.2 EBV 陽(yáng)性的 Akata 細(xì)胞更易與上皮細(xì)胞形成 heterotypic cell-in-cell結(jié)構(gòu)
        4.3.3 Akata 細(xì)胞可鉆入 CNE-2 細(xì)胞并將 EBV 病毒攜帶進(jìn)入 CNE-2 細(xì)胞
        4.3.4 Heterotypic cell-in-cell 可有效介導(dǎo) CNE-2 細(xì)胞感染 EBV 病毒
        4.3.5 PI3K/AKT 和 1/2 ERK/MAPK 信號(hào)通路參與胞內(nèi)病毒的活化及包裝
        4.3.6 藥物抑制 AKT 的磷酸化或 ERK 的磷酸化均可以有效抑制胞內(nèi)病毒的活化
        4.3.7 In cell infection 得到的 CNE-2 可包裝病毒進(jìn)而感染易感和非易感細(xì)胞
        4.3.8 Heterotypic cell-in-cell 介導(dǎo)的感染方式也是 HIV 的感染途徑之一
    4.4 本章小結(jié)
結(jié)論與展望
    結(jié)論
    創(chuàng)新性成果
    展望
參考文獻(xiàn)
攻讀博士學(xué)位期間取得的研究成果
致謝
附件

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2835081