tPA(tissue-type plasminogen activator)是活性和特異性最強(qiáng)的一種溶栓藥物,但在體內(nèi)短暫的半衰期很大程度上阻礙著該藥發(fā)揮應(yīng)有的作用。我們設(shè)想更高活性的tPA能在一定程度上緩解這一矛盾。 DNA改組(DNA shuffling)技術(shù)的問世為人們獲得更高活性的基因表達(dá)產(chǎn)物提供了一個全新的技術(shù)平臺。然而,迄今為止DNA改組仍只限于對原核表達(dá)產(chǎn)物有活性的一組基因的改組,對那些只有真核表達(dá)才有活性的基因的改組,由于篩選中存在的一系列困難而受阻。所以真核表達(dá)改組是人們努力的一個方向。本研究對這一技術(shù)在tPA分子定向進(jìn)化中應(yīng)用的可能性進(jìn)行了探討,期望這一探索性結(jié)果能夠為后續(xù)幾輪的tPA DNA改組探明道路,為最終從改組后tPA多樣性基因庫中篩選到比較理想的重組體打下基礎(chǔ),也為其它需要以真核表達(dá)為基礎(chǔ)的DNA改組提供可借鑒的經(jīng)驗。 首先我們采用RT-PCR方法獲得一組哺乳類動物tPA的cDNA基因,包括大白鼠、恒河猴、人的tPA cDNA。將這些基因分別進(jìn)行克隆、測序、原核與真核表達(dá)。測序結(jié)果表明恒河猴tPA cDNA編碼區(qū)(含信號肽)與發(fā)表的人tPA cDNA編碼區(qū)的核苷酸序列同源性為96%,由此所推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性為97.5%。大白鼠tPA cDNA編碼區(qū)(含信號肽)與文獻(xiàn)發(fā)表的大白鼠tPA cDNA編碼區(qū)的核苷酸序列,除2個堿基不同外,其余完全相同,與發(fā)表的人tPA cDNA編碼區(qū)的核苷酸序列同源性約為80%(不含信號肽),由此所推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性為83%。本實驗所用的人tPA cDNA由本室提供,是經(jīng)基因突變改造過的第二代人tPA基因。將恒河猴、大白鼠、人tPA cDNA克隆于真核表達(dá)載體,轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞后表達(dá)出了有活性的tPA。培養(yǎng)上清檢測結(jié)果顯示人tPA在CHO細(xì)胞中表達(dá)產(chǎn)物的活性最高,恒河猴和大白鼠tPA的活性明顯低于人tPA的活性。將這三種tPA基因分別克隆于原核表達(dá)載體,結(jié)果表明原核表達(dá)產(chǎn)物幾乎沒有活性。 一個合適的表達(dá)篩選系統(tǒng)是DNA改組成功的關(guān)鍵。由于tPA只能在真核細(xì)胞中表達(dá)才有活性,所以DNA改組后的篩選只能建立在真核表達(dá)的基礎(chǔ)上,這就意味著需要完成大量的探索性工作。本研究探索了DNA改組后的篩選途徑,建立了大規(guī)模tPA活性篩選檢測的方法。1.篩選途徑:就是建立在真核表達(dá)系統(tǒng)的基礎(chǔ)上,通過對單個細(xì)胞的克隆分離,實現(xiàn)篩選的第一步。真核表達(dá)中單個細(xì)胞克隆的獲得比原核表達(dá)中單菌落的獲得其難度和工作量要大得多。我們采用了稀釋細(xì)胞,96孔板克隆的方法,從中摸索出了一些可行的經(jīng)驗和方法。2.篩選檢測方法:大規(guī)模篩選的檢測方法也是DNA改組的關(guān)鍵。DNA改組后的篩選檢測方法不同于其他一些表達(dá)產(chǎn)物的檢測可用簡便的免疫學(xué)檢測方法,改組后的篩選必須要檢測表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)活性,而且是大規(guī)模的檢測。傳統(tǒng)的tPA活性檢測方法是瓊脂平板法。該方法一次只能做幾份至幾十份的樣品,無法適用于改組后一次完成幾千至幾萬份樣品的檢測。我們將此方法進(jìn)行了改良,建立了適用于tPA DNA改組后大樣品量檢測的篩選方法。 在上述的基礎(chǔ)工作準(zhǔn)備完成后,我們以人tPA cDNA、恒河猴及大白鼠tPA
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2001
【中圖分類】：R346
【文章目錄】：
中文摘要
英文摘要
前言
第一部分 大白鼠、恒河猴、人tPA基因的克隆、測序與表達(dá)
第二部分 以三種tPA cDNA為基礎(chǔ)的DNA改組與篩選
第三部分 人tPA的其它分子生物學(xué)改構(gòu)
小結(jié)
參考文獻(xiàn)
綜述
致謝

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉士輝,黃培堂,黃翠芬;組織型纖溶酶原激活劑突變體的構(gòu)建、表達(dá)及特性分析[J];中國科學(xué)(B輯 化學(xué) 生命科學(xué) 地學(xué));1995年04期

2 劉國奇,陳小密,徐靜,宋宏彬,于長明,童貽剛,王海濤;攜帶共擴(kuò)增基因的CHO細(xì)胞表達(dá)載體的構(gòu)建[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2000年01期

本文編號：2830531