齲病(Dental caries)是發(fā)生在牙齒硬組織(牙釉質)的細菌感染性疾病。該病在全球發(fā)病率高、流行范圍廣，是嚴重危害人類健康的主要口腔疾病之一。長期以來，經過各個國家的努力，采取各種方法預防齲病的發(fā)生，特別是氟化物的應用，使齲病的預防收到了明顯的效果。但是目前的控制措施還未能完全有效地控制齲病的發(fā)生。同時由于氟化物的長期使用，出現(xiàn)了耐氟菌株，這使齲病的預防形勢更加嚴峻。這就迫切需要人們開發(fā)新的預防齲病的措施及治療藥物。 鏈球菌群中的變形鏈球菌(Streptococcus mutans)為主要致齲菌。變形鏈球菌引起齲病的先決條件是其必須在牙齒表面定植，形成生物膜(Biofilm)即牙菌斑(Dental plaque)。定植在牙菌斑內的變形鏈球菌可以發(fā)酵蔗糖產酸，使牙釉質脫礦。形成生物膜被認為是多種口腔致病菌致病因素之一。因此尋找可以抑制變形鏈球菌及其生物膜的方法，是齲病預防、治療的有效措施。 抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是具有抗菌(包括細菌、真菌)活性短肽的總稱，具有廣泛的殺菌活性。細菌細胞壁是維持細菌生存所必需的基本結構之一，與真核細胞不同，其主要的化學成分是肽聚糖。肽聚糖合成中的一個關鍵反應是UDP-N-乙酰葡糖胺(UDP-GlcNAc)與磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)轉化為UDP-N-乙�；�-3-O-(1-羧基乙烯基)-D-葡糖胺(UDP-N-乙酰葡糖胺烯醇丙酮酸，UDP-Glc-NAc-EP)。MurA(UDP-N-乙酰葡萄糖胺烯醇式丙酮酸轉移酶)是催化此反應的酶，因此它是肽聚糖合成過程中的一個關鍵酶。由于此反應途徑無代謝旁路，并且在人體中不存在此種代謝途徑。MurA酶可能是研制預防齲病藥物的作用靶點之一。 因此，本課題的研究工作包括兩部分。(1)篩選針對致齲性變形鏈球菌及其生物膜有效的抗菌肽，并揭示其作用機制。(2)針對變形鏈球菌細胞壁肽聚糖合成關鍵酶MurA作為藥物靶點，通過克隆表達得到MurA蛋白，對其進行酶促動力學研究，建立高通量篩選MurA酶抑制劑的分子模型。 第一部分取得的研究結果： 1.抗菌肽對S. mutans的最低抑菌濃度(MIC) 應用96孔板微孔培養(yǎng)基稀釋方法測定三種抗菌肽(P-113、PAC-525、D-Nal-Pac-525)對S. mutans的MIC。MIC分別為P-113＞16μg/ml，PAC-5258μg/ml，D-NAL-PAC-5254μg/ml。確定最佳抗菌肽為D-Nal-Pac-525。 2. D-Nal-Pac-525對S. mutans的生長抑制作用 將不同濃度的D-Nal-Pac-525加入到對數(shù)期初期的S. mutans培養(yǎng)液中，于不同時間點取樣，測OD600，繪制生長曲線。結果顯示，當D-Nal-Pac-525濃度為2μg/ml S. mutans生長趨勢沒有變化，但當其濃度升高到4μg/ml S. mutans生長受到明顯抑制。 3. D-Nal-Pac-525對S. mutans的殺菌活性 將D-Nal-Pac-525(終濃度分別為1、2、4μg/ml)加入到S. mutans培養(yǎng)液中(~1×108CFU/ml)，厭氧培養(yǎng)，分別在2、4h取樣，進行活菌計數(shù)，當D-Nal-Pac-525濃度在4g/ml時，與未加藥的對照相比S. mutans活菌數(shù)量顯著減少。 4.掃描電鏡觀察D-Nal-Pac-525引起S. mutans形態(tài)學的變化 將D-Nal-Pac-525加入到S. mutans(~108CFU/ml)培養(yǎng)液中，至終濃度為4μg/ml。37oC厭氧培養(yǎng)4h。離心后收集菌體，標本經過處理固定后用SEM進行觀察。與未處理的對照組相比，D-Nal-Pac-525處理后的S. mutans呈現(xiàn)明顯的形態(tài)學變化。處理組細菌菌體明顯變長，菌體表面粗糙有皺褶。同時在處理組的照片上觀察到細菌崩解之后形成的碎片。 5.透射電鏡觀察D-Nal-Pac-525引起S. mutans結構的變化 同樣將D-Nal-Pac-525加入到S. mutans(~108CFU/ml)培養(yǎng)液中，至終濃度為4μg/ml。37oC厭氧培養(yǎng)4h。離心后收集菌體，標本經過處理固定后用TEM進行觀察。D-Nal-Pac-525對S. mutans菌體表面結構的破壞作用。鏡下未處理組菌體表面結構均一，呈高密度線。處理組菌體表面結構變模糊，甚至遭到破壞。同時在處理組菌體內部出現(xiàn)了高密度區(qū)域、細菌染色體凝集現(xiàn)象，胞內物質凝集及菌體細胞質膜破壞的現(xiàn)象。 6. D-Nal-Pac-525抑制S. mutans生物膜的形成 在PVC96孔板上建立S. mutans生物膜模型。將不同濃度的D-Nal-Pac-525(終濃度為0.25，0.5，1，2，4μg/ml)與S. mutans(~1×105CFU/ml)BHI培養(yǎng)基菌液(含3%蔗糖)共培養(yǎng)。結果顯示D-Nal-Pac-525在濃度為2g/ml時可以抑制S. mutans生物膜的形成。OD600結果驗證了肉眼觀察的結果。D-Nal-Pac-525對已經形成的生物膜沒有破壞作用。 7.對S. mutans生物膜相關基因的轉錄水平沒有影響 經過D-Nal-Pac-525(4μg/ml)處理4h，S. mutans生物膜相關基因(brpA、vicR及gbpA)的轉錄水平沒有發(fā)生變化。 第二部分取得的研究結果： 1.表達載體pET16b-Smu murA的構建 從S. mutans UA159菌株基因組數(shù)據庫中查詢出變形鏈球菌(UA159)murA基因(SMU_1525)的核苷酸序列(大小為1272bp)。設計PCR引物，在上、下游引物的5’端分別加入Nde I和Xho I限制性內切酶位點。以S. mutans UA159基因組DNA為模板，擴增出S. mutans murA基因。 將PCR產物與pMD18T克隆載體連接，再將其轉化入感受態(tài)大腸桿菌Novablue中。用限制性內切酶Hind Ⅲ和EcoR I酶切的方法鑒定重組質粒。對pMD18-Smu murA中的murA基因進行DNA序列測定。將所測得的核苷酸序列與S. mutans UA159murA (SMU_1525)基因進行序列比對，完全一致。說明在本實驗中獲得的murA為正確的S. mutans UA159murA基因。再用Nde I、Xho I雙酶切pMD18-Smu murA質粒�；厥�、純化murA基因，連接到pET16b表達質粒的Nde I和Xho I位點，構建pET16b-Smu murA表達載體。用EcoR I酶鑒定陽性重組質粒。 2. S. mutans MurA蛋白在大腸桿菌BL21(DE3)中的表達、純化 將pET16b-Smu murA表達載體轉入大腸桿菌BL21(DE3)中。在37oC振蕩培養(yǎng)3小時，達到對數(shù)生長期。然后加入終濃度為0.5mM IPTG，室溫誘導細菌8小時，誘導攜帶pET16b-Smu murA表達載體的BL21(DE3)菌株表達重組MurA蛋白。MurA蛋白的N端與質粒pET16b上的組氨酸標簽形成融合蛋白。用超聲破碎誘導后的BL21(DE3)。分別對上清、沉淀組分進行SDS-PAGE和Westernblotting，結果表明S. mutans MurA蛋白在BL21(DE3)菌株中可溶性表達。 用組氨酸-Ni2+親和層析技術純化MurA蛋白。對蛋白進行蛋白定量(考馬斯亮藍法)，其中第2管MurA蛋白的濃度為1150μg/ml。SDS-PAGE和Westernblotting結果表明MurA蛋白的純度較高。 3. S. mutans MurA酶活性測定方法的建立 (1)高效液相色譜法(HPLC)：用Nova-Pak C18色譜柱，以三乙胺-醋酸緩沖液為流動相，在260nm處檢測反應底物UDP-GlcNAc的減少。 (2)化學顯色法：S. mutans MurA催化反應的產物之一為磷酸，磷酸可以與鉬酸銨形成磷鉬酸復合物后使孔雀石綠顏色由黃綠變?yōu)樗{綠。用酶標儀在620nm處檢測吸光值變化，以測定所生成磷酸的含量。 4. S. mutans MurA蛋白酶促反應動力學特性的研究 反應底物UDP-GlcNAc和PEP與不同濃度MurA在37oC反應不同時間。結果表明S. mutans MurA反應初速度酶濃度范圍為1.84μg/ml，時間范圍為5min。 分別改變反應的溫度和pH值，利用酶標儀在620nm處吸光度值的變化，計算反應產物的生成量。確定S. mutans MurA酶蛋白的最適反應溫度是37oC，最適pH值是7.5。 采用最佳反應條件，保證一種底物過量，改變另一種底物濃度采用雙倒數(shù)法測其Km值和Vmax。37oC，pH7.5，酶濃度為1.84μg/ml，反應時間為5分鐘。分別用不同的底物濃度，進行酶促反應。利用酶標儀檢測620nm處吸光度值，反應產物的生成量。用雙倒數(shù)作圖法得出S. mutans MurA的Km值和Vmax。對于底物PEP，Km值為0.086±0.001mM，Vmax為0.098±0.001mM min-1mg-1。對于底物UDP-GlcNAc的Km值為0.120±0.005mM，最大速率Vmax為0.048±0.002mM min-1mg-1。 5.磷霉素對S. mutans MurA功能的驗證 用磷霉素(Fosfomycin)進一步鑒定純化的S. mutans MurA功能。將一定濃度的磷霉素與MurA蛋白在室溫下預孵(preincubation)10min后，檢測MurA蛋白活性變化。MurA酶的活性受到磷霉素抑制。在UDP-GlcNAc存在情況下，MurA受到的抑制作用更加明顯。從而證明S. mutans MurA具有UDP-N-乙酰葡萄糖胺烯醇式丙酮酸轉移酶活性。 結論：1.篩選的抗菌肽D-Nal-Pac-525可以抑制變形鏈球菌的生長及生物膜的形成，D-Nal-Pac-525可能成為新的預防齲病藥物。 2.構建了高表達S. mutans MurA蛋白的工程菌株，可以獲得大量可溶性MurA蛋白。 3.建立了快速、準確測定MurA酶活性的方法，并建立了高通量篩選MurA酶抑制劑的分子模型，為小分子抑制劑的篩選提供了物質保障。
【學位單位】：大連醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2013
【中圖分類】：R781.1;R3411
【文章目錄】：
摘要
Abstract
前言
    參考文獻
第一章 抗菌肽 D-Nal-Pac-525 對變形鏈球菌生長及其生物膜形成影響的實驗研究
    材料和方法
        1. 材料
            1.1 菌株
            1.2 抗菌肽的制備
            1.3 主要試劑
            1.4 主要儀器
        2. 方法
            2.1 變形鏈球菌生長曲線的測定
            2.2 抗菌肽最低抑菌濃度 ( M I C ） 的測定
            2.3 D-Nal-Pac-525 對 S.mutans 生長抑制試驗
            2.4 D-Nal-Pac-525 對 S.mutans 殺菌活性試驗
            2.5 掃描電鏡
            2.6 透射電鏡
            2.7 生物膜實驗
            2.8 生物膜相關基因轉錄水平的 RT-PCR
            2.9 統(tǒng)計分析方法
    結果
        1. S.mutans UA159 的微生物學一般特征
        2. S.mutans 生長曲線的測定
        3. 抗菌肽最低抑菌濃度 ( M I C ） 的測定
        4. D-Nal-Pac-525 對變形鏈球菌生長抑制試驗
        5. D-Nal-Pac-525 對 S.mutans 殺菌活性的測定
        6. SEM 觀察 D-Nal-Pac-525 引起的形態(tài)學變化
        7. TEM 觀察 D-Nal-Pac-525 引起的結構變化
        8. D-Nal-Pac-525 對變形鏈球菌生物膜的作用
        9. D-Nal-Pac-525 對生物膜相關基因轉錄水平的影響
    討論
    結論
    參考文獻
第二章 變形鏈球菌 MurA(UDP-N-乙酰葡萄糖胺烯醇式丙酮酸轉移酶） 的表達、純化及酶促反應動力學研究
    材料和方法
        1. 材料
            1.1 質粒、菌種
            1.2 主要試劑
            1.3 主要儀器
        2. 方法
            2.1 S.mutans 基因組的制備
            2.2 S.mutans murA 基因的擴增及純化
            2.3 pMD18-Smu murA 重組質粒的構建
            2.4 pET16b-Smu murA 表達載體的構建
            2.5 S.mutans MurA 蛋白在在大腸桿菌 BL21 (DE3） 中的可溶性表達與鑒定
            2.6 S.mutans MurA 酶活性的測定
            2.7 S.mutans MurA 酶的酶促動力學研究
            2.8 應用磷霉素驗證 S.mutans MurA 的功能 49
    結果
        1. S.mutans murA 基因的擴增及純化
        2. pMD18-Smu murA 重組質粒的構建
        3. S.mutans UA159 murA PCR 產物的 DNA 序列測定
        4. p E T 16 b - S m u m u r A 表達載體的構建
        5. S.mutans MurA 在大腸桿菌 BL21(DE3） 中的表達、純化與鑒定
        6. S.mutans MurA 酶活性檢測方法的建立
        7. S.mutans MurA 酶促反應動力學的研究
            7.1 M u r A 酶初速度的確定
            7.2 S.mutans MurA 酶最佳溫度及 pH 值的確定
            7.3 底物對 M u r A 酶的 K m 值
        8. 用磷霉素進行 S.mutans MurA 酶功能的驗證
    討論
    結論
    參考文獻
綜述
    參考文獻
附錄
攻讀學位期間發(fā)表文章情況
致謝

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 周霞,諸葛洪祥;抗菌肽的分子生物學研究進展[J];國外醫(yī)學.流行病學.傳染病學分冊;2002年05期

2 安春菊,盛長忠,李德森,杜榮騫;一類潛在的新藥——抗菌肽[J];中國新藥雜志;2003年09期

3 鄧平建,房師松,楊冬燕,姜麗華,余祥強,黃永彤,黃自然;轉抗菌肽CAD基因酵母飼料添加劑的安全性評價[J];衛(wèi)生研究;2004年05期

4 劉先凱,趙彤言;昆蟲抗菌肽研究進展[J];寄生蟲與醫(yī)學昆蟲學報;2001年02期

5 張衛(wèi)民,周殿元;抗菌肽與幽門螺桿菌感染[J];生命的化學;2003年01期

6 龔家瑋;合成抗菌肽P18及其截短肽的結構和殺真菌活性[J];中國醫(yī)藥工業(yè)雜志;2004年07期

7 馮興軍,王建華,單安山;抗菌肽Lactoferricin生物學功能及其應用研究進展[J];天然產物研究與開發(fā);2005年01期

8 趙瑞君,劉成芳,董建臻,張亞尼;家蠅抗菌肽的誘導提取及篩選[J];熱帶醫(yī)學雜志;2005年02期

9 胡云龍，郭玉梅，趙學忠，戴祝英;昆蟲抗菌肽作用于K_（562）細胞病理過程的超微結構研究[J];中國媒介生物學及控制雜志;1995年01期

10 邱曉燕,劉艷,陳小麟,陳奕欣;舍蠅抗菌肽的提取及其對腫瘤細胞生長的抑制作用[J];中華衛(wèi)生殺蟲藥械;2003年01期

相關會議論文 前10條

1 王靜;祝平;;抗菌肽在養(yǎng)殖生產中的應用研究進展[A];2008山東飼料科學技術交流大會論文集[C];2008年

2 梁延彬;;抗菌肽在養(yǎng)豬業(yè)中的應用進展[A];2011豬免疫抑制病防控與營養(yǎng)保健技術專題論壇會刊[C];2011年

3 明雙喜;王沂蒙;劉艷;江國托;;抗菌肽作用機理及其在生產方面的研究進展[A];格萊姆抗菌肽——抗菌肽開發(fā)與應用技術研討會論文集[C];2009年

4 張東玲;黃文樹;粱英;關瑞章;宋凱;;日本鰻鱺肝臟抗菌肽的分離純化[A];“細胞活動 生命活力”——中國細胞生物學學會全體會員代表大會暨第十二次學術大會論文摘要集[C];2011年

5 陸婕;鐘雅;柳林;付康;陳正望;;家蠅蛆抗菌肽提取工藝研究[A];格萊姆抗菌肽——抗菌肽開發(fā)與應用技術研討會論文集[C];2009年

6 馬清泉;單安山;董娜;曹艷萍;;新型抗菌肽的分子設計和活性檢測[A];第六次全國飼料營養(yǎng)學術研討會論文集[C];2010年

7 彭兵;張樹斌;王立安;;枯草芽孢桿菌菌株A抗菌肽的分離純化及抗真菌機理[A];格萊姆抗菌肽——抗菌肽開發(fā)與應用技術研討會論文集[C];2009年

8 袁天虎;張欣;胡澤汗;王芳;雷鳴;;抗菌肽Piscidin 1及其突變體穩(wěn)定性的動力學研究[A];中國化學會第28屆學術年會第13分會場摘要集[C];2012年

9 趙瑞君;劉顏崗;程t熛

本文編號：2830206