發(fā)布時間：2020-09-28 22:12

　　 目的 脊髓損傷是一類嚴(yán)重威脅人類健康的創(chuàng)傷，目前尚無有效的治療方法。 已知脊髓損傷修復(fù)過程中神經(jīng)再生、再次髓鞘形成和死亡神經(jīng)元的替代都需要面 對膠質(zhì)瘢痕及復(fù)雜的不利于神經(jīng)再生的內(nèi)環(huán)境，現(xiàn)已證實(shí)膠質(zhì)瘢痕能抑制軸索生 長和髓鞘形成。膠質(zhì)瘢痕最主要成分是星形膠質(zhì)細(xì)胞，因此某些實(shí)驗(yàn)策略為通過 抑制膠質(zhì)細(xì)胞增殖而促進(jìn)神經(jīng)再生。肝細(xì)胞生長因子(HGF)具有抑制瘢痕的作 用。本研究將腺病毒介導(dǎo)的肝細(xì)胞生長因子轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，并對 該細(xì)胞進(jìn)行劃傷以模擬體內(nèi)損傷，觀察HGF對星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的影響。 方法和結(jié)果(1) 在轉(zhuǎn)染有綠色熒光蛋白基因的新生大鼠脊髓原代培養(yǎng)星形膠 質(zhì)細(xì)胞中，觀察到腺病毒對膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率較高。以相應(yīng)的Ad-HGF轉(zhuǎn)染該細(xì) 胞后在培養(yǎng)液上清中有HGF表達(dá)。用間隔3mm的縱橫平行線為模板對用6孔板 培養(yǎng)的該細(xì)胞進(jìn)行劃傷，制備體外損傷模型。通過檢測星形膠質(zhì)細(xì)胞特征性蛋白 膠質(zhì)纖維酸性蛋白含量和細(xì)胞周期中S期比例，觀察轉(zhuǎn)染Ad-HGF的細(xì)胞在劃傷 后不同時間點(diǎn)細(xì)胞增殖情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ad-HGF在細(xì)胞劃傷后第一天對增殖有明 顯抑制作用：(2) 3H摻入法觀察HGF蛋白對正常培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用，發(fā)現(xiàn) HGF對正常培養(yǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞無明顯作用；(3) 細(xì)胞劃傷后用HGF蛋白作用30min， 通過檢測促分裂原活化蛋白激酶(P42／414 MAPK)中表達(dá)和-磷酸鞘氨醇(SPP)，途徑中 關(guān)鍵酶SPK水平，觀察這兩條對細(xì)胞增殖相關(guān)的信號途徑，發(fā)現(xiàn)P42／44 MAPK這 條途徑在膠質(zhì)細(xì)胞中活性很高，顯示可能對其生理功能有重要作用，但并沒有因 HGF蛋白作用而增強(qiáng)。而SPK卻在HGF蛋白低劑量作用下高表達(dá)，高劑量時表 達(dá)下降，說明HGF對其可能有雙重作用：(4) 通過不同劑量HGF蛋白對星形膠質(zhì) 細(xì)胞損傷后的影響，進(jìn)一步闡明HGF對損傷后星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖的作用。 結(jié)論 肝細(xì)胞生長因子對正常生長的星形膠質(zhì)細(xì)胞無作用，而對劃傷的星形 膠質(zhì)細(xì)胞的增殖具有雙重作用，在低劑量是促進(jìn)、高劑量時抑制增殖，SPP信號途 博士論文----一中文摘要 徑在其中發(fā)揮作用。 第二部分肝細(xì)胞生長因子對脊髓神經(jīng)再生的實(shí)驗(yàn)研究 目的治療脊髓損傷的關(guān)鍵是促進(jìn)神經(jīng)再生，盡管目前還未徹底了解神經(jīng)軸 索的再生機(jī)制，但研究表明，合適的微環(huán)境可以促進(jìn)中樞神經(jīng)再生�；蛑委熂� 髓損傷的策略就是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提供一種合適的微環(huán)境，而目前主要是向局部 提供神經(jīng)營養(yǎng)因子。神經(jīng)系統(tǒng)中HGF廣泛存在，且在大鼠發(fā)育的不同階段，在大 腦不同部位HGF及受體表達(dá)量均有差異，提示其對大腦皮層神經(jīng)元的分化、運(yùn)動、 存活和神經(jīng)發(fā)生上起作用。此外還觀察到它對體外培養(yǎng)的皮層神經(jīng)細(xì)胞有營養(yǎng)和 保護(hù)作用。迄今沒有HGF對中樞神經(jīng)再生作用的報道，本研究通過觀察HGF蛋 白對體外培養(yǎng)脊髓神經(jīng)組織離斷突起的作用，證實(shí)HGF能促進(jìn)神經(jīng)再生，并在體 內(nèi)通過Ad一HGF轉(zhuǎn)染進(jìn)一步證實(shí)其能促進(jìn)皮質(zhì)脊髓束的再生，為其在脊髓損傷中 的應(yīng)用，奠定一定的理論基礎(chǔ)。 方法和結(jié)果(l)建立一種體外觀察神經(jīng)再生的方法:首先鋪鼠尾膠原，然后 接種胚鼠脊髓組織塊，待5天后在發(fā)出突起部位約100一150um處將長出的突起離 斷，于離斷遠(yuǎn)端去除一塊鼠尾膠原并重新鋪膠，待膠固化后添加培養(yǎng)基，在原位 觀察神經(jīng)再生;(2)用建立的組織快模型觀察HGF蛋白對神經(jīng)再生的作用。重新鋪 膠后換成N:條件培養(yǎng)基，24h:后通過觀察再生突起的長度判斷再生情況。結(jié)果證 實(shí)HGF對神經(jīng)再生有促進(jìn)作用;(3)體內(nèi)進(jìn)行Ad一GFP轉(zhuǎn)染。通過冰凍切片觀察轉(zhuǎn) 染效果，發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)染后1一2周時綠色熒光表達(dá)最強(qiáng)，直到第8周仍有表達(dá);(4)脊髓 內(nèi)轉(zhuǎn)染Ad一HGF，并于轉(zhuǎn)染同時進(jìn)行脊髓左側(cè)部分，背測2/3部分離斷，2個月后 通過生物胞素順行示蹤觀察皮質(zhì)脊髓束再生狀況，進(jìn)一步證實(shí)HGF對神經(jīng)再生有 促進(jìn)作用。 結(jié)論建立了一種原位觀察神經(jīng)突起再生的方法，在此基礎(chǔ)上證實(shí)肝細(xì)胞生 長因子體外能促進(jìn)脊髓組織神經(jīng)突起再生，體內(nèi)能促進(jìn)皮質(zhì)脊髓束再生。
【學(xué)位單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2004
【中圖分類】：R346
【部分圖文】：

圖1.2星型膠質(zhì)細(xì)胞(Ast)X200倍圖1.3AST免疫組化x100倍圖1.4AST免疫熒光X100倍圖1.5AST轉(zhuǎn)染Ad~GFP，MOI100，X200倍圖1.6AST劃傷模板圖

圖1.2星型膠質(zhì)細(xì)胞(Ast)X200倍圖1.3AST免疫組化x100倍圖1.4AST免疫熒光X100倍圖1.5AST轉(zhuǎn)染Ad~GFP，MOI100，X200倍圖1.6AST劃傷模板圖

AST免疫熒光X100倍

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2829343