肝臟是人體各種物質(zhì)代謝、能量轉(zhuǎn)換的樞紐消化器官，是機(jī)體內(nèi)多種重要信息調(diào)控分子的重要場(chǎng)所。肝臟具有很強(qiáng)大的再生能力，物理性及化學(xué)性創(chuàng)傷和各種肝臟病后，殘存的肝臟組織很快會(huì)進(jìn)入復(fù)雜的肝再生過程。肝再生過程基本可分為三個(gè)階段：早期階段（啟動(dòng)期），中期階段（增殖期）和晚期階段（終止期）。肝再生一直是肝臟研究中的一個(gè)重要焦點(diǎn)，原發(fā)性肝癌、肝內(nèi)膽結(jié)石等肝臟病進(jìn)行肝部分切除術(shù)后常因肝功能儲(chǔ)備不足，術(shù)后并發(fā)肝功能衰竭而死亡率較高。因此研究肝再生分子機(jī)理對(duì)于解釋肝臟病人肝葉切除術(shù)后殘余肝臟的再生機(jī)制，實(shí)施有效的促肝細(xì)胞增殖能力的手段，減輕肝葉切除術(shù)后的肝損害及評(píng)估預(yù)后具有重要的臨床意義。 因?yàn)橛绊懜渭?xì)胞再生的機(jī)制的因素非常復(fù)雜，對(duì)肝臟再生的啟動(dòng)和增殖信號(hào)（包括激素、生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子等）的分子機(jī)制認(rèn)識(shí)有了初步了解。主要研究發(fā)現(xiàn)有細(xì)胞因子(IL-6、TNF-a)和轉(zhuǎn)錄因子(c-jun、STAT3)等組成啟動(dòng)肝再生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，進(jìn)而提高促有絲分裂因子對(duì)肝細(xì)胞的增殖能力的影響從而完成肝再生啟動(dòng)。在多種促有絲分裂因子如肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）、表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（TGF-a）等，以及輔有絲分裂因子去甲腎上腺素和胰島素等的共同作用下促使肝細(xì)胞進(jìn)入增殖階段，進(jìn)行細(xì)胞DNA合成和細(xì)胞有絲分裂。相關(guān)基因如c-myc、β-Catenin等，一些microRNA如miR-378、miR-221、miR-21等參與了這個(gè)復(fù)雜過程，但是對(duì)肝再生的分子作用機(jī)理，特別是肝再生不同再生階段的機(jī)制仍不清楚。全面闡釋肝再生過程中的調(diào)控機(jī)制，揭示肝再生過程中調(diào)控的關(guān)鍵分子，是研究肝細(xì)胞再生機(jī)制的關(guān)鍵科學(xué)問題。 隨著短鏈非編碼RNA（如microRNA）研究的深入，和一些新的克隆、測(cè)序和芯片（tiling array）技術(shù)的應(yīng)用，大量長(zhǎng)片段的非編碼RNA被發(fā)現(xiàn)，他們?cè)谏顒?dòng)中的重要意義逐漸被揭示。目前，將這一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度超過200nt的ncRNA稱為長(zhǎng)鏈非編碼RNA（Long noncoding RNA, LncRNA），哺乳動(dòng)物基因組序列中4%-9%的序列產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄本是lncRNA（相應(yīng)的蛋白編碼RNA的比例是1%）。已有的研究顯示，lncRNA參與了X染色體沉默、基因組印記、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾及核內(nèi)運(yùn)輸?shù)榷喾N重要的調(diào)控過程，在生理及病理過程中發(fā)揮著重要作用。如lincRNA-p21可被p53轉(zhuǎn)錄活化，并且可影響眾多p53靶基因的表達(dá)，在p53信號(hào)通路中起著重要的作用。Zhu等鑒定的膀胱癌中的一個(gè)長(zhǎng)鏈非編碼RNA-ncRAN在膀胱癌中高表達(dá)，并且和膀胱癌的侵襲、分期相關(guān)。在前期研究中本課題組利用肝癌與癌旁組織lncRNA芯片，鑒定出lncRNA-HEIH在肝癌組織中高表達(dá)，并且和病人預(yù)后成負(fù)相關(guān)，過表達(dá)lncRNA-HEIH可促進(jìn)肝癌的生長(zhǎng)。但哪些lncRNA參與了肝再生過程還未見報(bào)道。 第一部分H19通過形成myc相關(guān)的自反饋環(huán)路促進(jìn)肝細(xì)胞增殖 上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-mesenchymal transition, EMT）是上皮細(xì)胞來源的惡性腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移和侵襲能力的重要生物學(xué)過程，也是參與肝臟損傷修復(fù)的重要環(huán)節(jié)，肝再生過程中內(nèi)皮細(xì)胞分泌的肝生長(zhǎng)因子HGF可以誘導(dǎo)肝細(xì)胞發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），新近的研究發(fā)現(xiàn)肝再生過程中存在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）和間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET）的平衡，某些特定類型的上皮細(xì)胞發(fā)生上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化從而能夠獲得間質(zhì)表型，其中一些間質(zhì)細(xì)胞能夠產(chǎn)生大量的細(xì)胞外基質(zhì)最終導(dǎo)致肝的纖維化；但是另一些間質(zhì)細(xì)胞能夠經(jīng)過其反過程間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化，這些間質(zhì)細(xì)胞重新轉(zhuǎn)變成上皮細(xì)胞，最終形成正常的肝細(xì)胞，使得損傷肝臟的修復(fù)正常，因此研究肝再生過程中調(diào)控肝細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的新分子及其作用機(jī)制，對(duì)理解肝再生損傷修復(fù)的過程的分子機(jī)制有理論意義。但目前哪些lncRNA通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化而參與了肝再生過程還未見報(bào)道。 H19是一個(gè)已知的長(zhǎng)2.3kb的非編碼RNA分子，其母系等位基因表達(dá)，父系印跡，在哺乳動(dòng)物中呈現(xiàn)進(jìn)化上的保守性，是最早被鑒定的印跡基因之一。近年發(fā)現(xiàn)H19可以通過調(diào)控上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化在胚胎發(fā)育、腫瘤發(fā)生等過程中發(fā)揮重要作用，但目前H19調(diào)控肝再生的機(jī)制還尚不明確。 因此本課題建立小鼠肝大部分切除的肝再生模型，發(fā)現(xiàn)了在肝再生過程中發(fā)揮重要作用的已知長(zhǎng)鏈非編碼RNA H19。揭示了H19在肝再生過程中的調(diào)控機(jī)制：H19的5’端可與hnRNP U蛋白相互作用，并且增強(qiáng)了下游c-myc mRNA的穩(wěn)定性使之上調(diào)表達(dá)，從而促進(jìn)了肝細(xì)胞的增殖能力。同時(shí)，c-myc可以與H19的啟動(dòng)子區(qū)結(jié)合從而促進(jìn)了H19的上調(diào)表達(dá)，形成H19的自反饋環(huán)路。H19/hnRNP U/c-myc調(diào)控網(wǎng)絡(luò)通過調(diào)控EMT過程增強(qiáng)了H19在肝再生過程中促進(jìn)肝細(xì)胞增殖能力的作用。 第二部分lncRNA-LALR1通過激活Wnt/β-Catenin信號(hào)通路促進(jìn)肝細(xì)胞增殖 Wnt/β-Catenin信號(hào)通路在眾多組織中是調(diào)控細(xì)胞增殖、分化和遷移的重要通路，在許多組織的損傷修復(fù)中都發(fā)現(xiàn)存在Wnt/β-Catenin信號(hào)通路的活化，并且這種活化與組織損傷修復(fù)能力和成瘤傾向有關(guān)。在肝臟中，越來越多的證據(jù)表明Wnt/β-Catenin信號(hào)通路在肝臟的各種生物學(xué)功能中發(fā)揮著重要作用。近年來的研究表明，Wnt/β-Catenin信號(hào)通路對(duì)于肝切除術(shù)后的肝臟再生至關(guān)重要。但是哪些lncRNAs通過調(diào)控Wnt/β-Catenin信號(hào)通路促進(jìn)了肝細(xì)胞的增殖及肝臟的再生依然尚未明確。 因此本課題建立小鼠肝大部分切除的肝再生模型，通過lncRNA芯片篩選得到在肝再生過程中發(fā)揮重要作用的lncRNA-LALR1。揭示了lncRNA-LALR1在肝再生過程中的調(diào)控機(jī)制：在肝再生過程中，肝生長(zhǎng)因子HGF上調(diào)，增加了lncRNA-LALR1表達(dá)。lncRNA-LALR1通過招募轉(zhuǎn)錄因子CTCF到AXIN1的啟動(dòng)子區(qū)抑制了Axin1的表達(dá)，激活了Wnt/β-Catenin信號(hào)通路，上調(diào)了cyclin D1的表達(dá)，加速了肝細(xì)胞G1期進(jìn)程，縮短了細(xì)胞周期，促進(jìn)了肝細(xì)胞增殖和肝臟再生。并在肝臟移植、各種肝病及肝腫瘤病人的組織中檢測(cè)lncRNA-LALR1表達(dá)量，期望lncRNA-LALR1可能成為各種肝病及肝腫瘤肝葉切除術(shù)預(yù)后評(píng)估的檢測(cè)指標(biāo)。
【學(xué)位單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R329.2
【部分圖文】：

肝再生過程中的 LncRNAs 調(diào)控肝細(xì)胞增殖的機(jī)制研究- 21 -圖1-1. LncRNA-H19是參與肝臟再生和發(fā)育的共同調(diào)節(jié)因子Fig. 1-1. LncRNA-H19 is a more pivotal mediator involved in liver regeneration anddevelopment.The levels of lncRNA-H19 and lncRNA-hcn expressions were increased after PHx inmice. The top change of H19 RNA (A) was higher than that of hcn RNA (B). (C) Anextremely high expression of H19 presented in mouse fetal liver tissues and then the H19expression was down-regulated sharply after birth in mice. (D) Hcn expression exibited amild upregulation in mouse fetal liver tissues compared to in mouse adult liver tissues.The changes of H19 expressions in liver tissues from mouse models treated with ethanol(E), CCl4(F) and DEN (G) reagents. (H) The pathological changes in the livers fromliver toxic reagent-treated mice. Data are mean ± SD (n=3). *P ≤0.05; **P ≤0.001.

第二軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文- 22 -圖1-2. lncRNA-H19和lncRNA-MALAT1在人胚胎肝細(xì)胞中的表達(dá)以及化學(xué)及酒精處理的小鼠肝臟病理改變Fig. 1-2. The expressions of lncRNA-H19 and lncRNA-MALAT1 in human primaryfetal hepatocytes.(A) Extremely high expression of H19 RNA in human primary fetal hepatocytescompared to in human immortal liver cells, LO2 cells. (B) Moderate increase ofMALAT1 in human primary fetal hepatocytes compared with in human immortal livercells, LO2 cells. (C-E). The pathological changes in the livers from liver toxicreagent-treated mice.（二）H19可以促進(jìn)小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞及小鼠胎肝細(xì)胞增殖能力小鼠大部分切除術(shù)后，肝細(xì)胞分泌大量的各種肝生長(zhǎng)因子從而激活了靜止的肝細(xì)胞使之進(jìn)入后續(xù)的細(xì)胞增殖階段重新恢復(fù)肝臟大小及功能，肝細(xì)胞增殖是肝

- 24 -圖1-3.H19促進(jìn)小鼠原代培養(yǎng)肝細(xì)胞及小鼠肝細(xì)胞系的增殖能力Fig. 1-3. H19 promotes hepatocyte proliferation and viability in primary mousehepatocytes and mouse liver cell lines.(A) The H19 expression was up-regulated in the primary mouse hepatocytes transfectedwith pcDNA-H19 compared to with empty pcDNA3.1 plasmids. (B) Ectopic expressionof H19 enhanced the cell proliferation rate of primary mouse hepatocytes. (C) BNL CL.2cells and Hepa1-6 cells exhibited significantly high expression of H19 in comparisionwith CCL-9.1 cells. (D) The expression of H19 was up-regulated in the BNL CL.2 cellstransfected with pcDNA-H19 plasmids compared to empty plasmids. Ectopic expression

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2829301