腎綜合征出血熱（HFRS）是一種由漢坦病毒屬病毒引起，臨床上主 要表現(xiàn)為發(fā)熱、出血和腎功能損害的急性病毒性傳染病。該病是我國死亡 人數(shù)最多的急性病毒性傳染病之一，年發(fā)病人數(shù)為5-10萬人，臨床病情 嚴(yán)重，病死率較高。目前尚缺乏特異有效的預(yù)防和治療方法。 漢坦病毒屬布尼亞病毒科，是一種有囊膜的單股負(fù)鏈RNA病毒，基 因組分為大（L）、中（M）、小（S）3個(gè)節(jié)段，分別編碼病毒的RNA依賴的RNA 聚合酶、囊膜糖蛋白（G_1和G_2）以及核蛋白（NP）。研究表明，漢坦病 毒的M基因編碼的囊膜糖蛋白（GP）可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體，而對感 染動(dòng)物和人體起到保護(hù)作用，且GP的中和抗原位點(diǎn)主要位于G_2上。但 GP免疫原性較弱，刺激產(chǎn)生的抗體出現(xiàn)晚，滴度不高。 本室前期研究結(jié)果表明，漢坦病毒S基因編碼的NP抗原位點(diǎn)主要集 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 一 中在8基因編碼區(qū)5’端約0．7＊b片段的編碼蛋白上。另外，NP八泊病》：Z 結(jié)構(gòu)蛋白中免疫原性最強(qiáng)，其刺激機(jī)體產(chǎn)生的特異性抗體出現(xiàn)早、澗度高、 維持時(shí)間長。國內(nèi)外研究結(jié)果均證實(shí)NP不僅具有很強(qiáng)的兔疫原性，而且 它也具有誘導(dǎo)免疫保護(hù)，包括誘導(dǎo)機(jī)休細(xì)胞免疫應(yīng)答的作用。因此，漢坦 病毒GP和NP在誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答中可能均起重要作用，如何發(fā)揮不同 結(jié)構(gòu)蛋白在誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答中的優(yōu)勢互補(bǔ)作用，是漢坦病毒基因工程疫 菌研究中亟待解決的問題。 本實(shí)驗(yàn)將編碼HTNV GZ的M基因片段與編碼NP氨基端aal274的 S基因片段進(jìn)行了融合表達(dá)，以期達(dá)到不同結(jié)構(gòu)蛋白在誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答 中的優(yōu)勢互補(bǔ)。首先，我們構(gòu)建了嵌合片段的原核表達(dá)載體pGEX4Tl －GZSO．7與pGEX＊T1．7G2，誘導(dǎo)表達(dá)了相應(yīng)的融合蛋白GST－G。NO．7、 GST－NO．7G2，并采用 SDS－PAGE、WestCS－blot及ELISA方法對表達(dá)產(chǎn)物 進(jìn)行鑒定。SDS．PAGE未能觀察到融合蛋白的表達(dá)帶：Western－h(huán)i血結(jié)果 表明，嵌合基因在原核表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了分子大小正確的融合蛋白，且該 融合蛋白與抗HINV NP特異性mAb有一定的結(jié)合活性：ELISA結(jié)果表 明，嵌合基因表達(dá)的融合蛋白不僅與抗HThV NP特異性mAb有較高的 結(jié)合活性，與抗HINV GP特異性mAb也有較弱的結(jié)合活性，證明該融合 蛋白保持了親本蛋白各自的活性。 在原核表達(dá)嵌合基因的基礎(chǔ)上，我們又構(gòu)建了嵌合基因及其親本基因 的真核表達(dá)載體pCDNA3．IGZSO．7、pCDNA3．ISO．7G2、pCDNA3．IG2以及 pCDNA3．1S．7，并進(jìn)一步研究了各重組真核表達(dá)載體在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中 的表達(dá)以及基因免疫對誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生體液及細(xì)胞免疫應(yīng)答的能力。同時(shí)我 們還比較了不同佐劑對基因免疫效果的影響。用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染COS－7細(xì) 胞，用RTPCR、間接免疫熒光法及免疫共沉淀檢測表達(dá)結(jié)果，結(jié)果表明 各重組質(zhì)粒在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中可以表達(dá)相應(yīng)的目的蛋白，且嵌合基因表達(dá) 呂 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 一 的的確為融合蛋白。用重組真核淡達(dá)8劃木見疫BALB兒小鼠，并川ELSA 法檢測免疫鼠血清特異性抗體，用細(xì)胞微顯培養(yǎng)中和試驗(yàn)檢測鼠免疫血消 中的中和抗體，用淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)檢測免疫鼠的細(xì)胞免疫應(yīng)答效果。 ELISA檢測結(jié)果表明，嵌合基因可同時(shí)誘導(dǎo)產(chǎn)生抗HTNV NP及GZ糖蛋 白的特異性抗體，且pCDNA3．IGZSO．7組的抗NP特異性抗體的效價(jià)與 pCDNA3．ISO．7組相當(dāng)，其抗GP特異性的抗體效價(jià)比pCDNA3．IGZ組要 高：而pCDNA3．ISO．7G2組與pCDNA3．ISO．7組及pCDNA3．IGZ組相比， 其抗體效價(jià)明顯低于這兩組；各組用佐劑免疫的小鼠，加空載體佐劑組刺 激機(jī)體產(chǎn)生抗體的水平明顯高于IL－2組與不加佐劑組。微量細(xì)胞培養(yǎng)中和 試驗(yàn)檢測結(jié)果表明，各免疫組小鼠均產(chǎn)生了不同滴度的中和抗體，但中和 抗體效價(jià)較低。淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)表明，嵌合基因免疫小鼠的脾細(xì)胞對 NP及GP的增殖指數(shù)均明顯高于空載體對照組；pCDNA3．IGZSO．7組增 殖指數(shù)比eDNA3．IS0．7組高，與pcDNA3．IGZ組相近：但pcDNA3．l －SO．7G2組未檢測到其淋巴細(xì)胞有明顯的增殖。淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)結(jié)果還 表明各組用佐劑免疫的小鼠，加空載體佐劑組刺激機(jī)體產(chǎn)生特異性細(xì)胞免 疫的水平明顯高于IL－2組與不加佐劑組。 以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，HWIV M基
【學(xué)位單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2001
【中圖分類】：R373.32

【引證文獻(xiàn)】

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1 胡剛;吳興安;王海濤;李璞媛;徐志凱;張芳琳;;漢坦病毒CTL多表位重組腺病毒的構(gòu)建及免疫學(xué)分析[J];科學(xué)技術(shù)與工程;2010年32期

2 胡剛;白文濤;吳興安;王海濤;徐志凱;張芳琳;;漢坦病毒嵌合基因G2S0.7與CTL多表位重組腺病毒的構(gòu)建及免疫學(xué)分析[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2010年11期

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本文編號：2825790