臨床試驗表明，hCGβ為基礎的避孕疫苗安全、有效且避孕效果可逆；但總有效率僅為80%－85%。不能在生殖道局部產(chǎn)生足夠的抗原特異性抗體，可能是避孕效果不完全的主要原因。通過粘膜免疫可在全身粘膜，包括生殖道局部產(chǎn)生高滴度的抗體，從而使其抗生育作用更加直接、有效。乳酸桿菌作為人體的正常菌群，可在粘膜局部持續(xù)表達抗原而誘發(fā)特異性免疫應答。因此，為了探索以乳酸桿菌作為載體表達抗原，經(jīng)粘膜免疫應用于避孕疫苗的可行性，本研究應用乳酸桿菌穩(wěn)定表達hCGβ，并經(jīng)陰道粘膜免疫小鼠，分析工程菌在陰道局部產(chǎn)生抗原的能力及陰道局部hCGβIgA抗體水平，并研究其相關機制。 第一部分：重組hCGβ乳酸桿菌的構(gòu)建及其體外分泌性表達 目的：構(gòu)建乳酸桿菌表達質(zhì)粒pIlac-hCGβ，轉(zhuǎn)化乳酸桿菌，使其穩(wěn)定地分泌表達hCGβ蛋白抗原。 方法：首先從短小乳酸桿菌基因組，PCR擴增得到670bp的S-層蛋白表達信號序列，將其信號肽序列與hCGβ基因連接后克隆入乳酸桿菌整合型表達載體pllac的lac啟動子下游，得到質(zhì)粒pllac-hCGβ；將pllac-hCGβ電穿孔轉(zhuǎn)化干酪氏乳酸桿菌Lactobacillus casei CECT5276，得到重組菌Lb casei hCGβ。PCR及測序分析外源基因在乳酸桿菌基因組中的整合情況，放免法分別檢測培養(yǎng)上清及細胞裂解液中的hCGβ，Western blotting鑒定培養(yǎng)上清中的hCGβ蛋白。將重組菌在無選擇壓力條件下培養(yǎng)50代后，接種培養(yǎng)，繼續(xù)檢測上清中目的蛋白的表達，并通過調(diào)整培養(yǎng)液的pH值、表達誘導劑乳糖濃度和表達抑制劑葡萄糖濃度，摸索表達效率最佳的培養(yǎng)條件。 結(jié)果：對重組乳酸桿菌基因組PCR產(chǎn)物測序，證實hCGβ基因已經(jīng)成功整合到Lb. casei的基因組中；重組菌產(chǎn)生的目的蛋白有78.5%分泌進入培養(yǎng)上清；而 WP=5 加入誘導劑乳糖后21小時，上清中的hCGβ濃度達到峰值，為440mIU/ml，其后逐漸下降。將重組菌在無選擇壓力條件下培養(yǎng)50代并凍存后仍可持續(xù)分泌hCGβ。調(diào)節(jié)培養(yǎng)液的pH值和乳糖濃度對重組菌分泌hCGβ的能力有影響，以pH值為7、誘導劑乳糖濃度為0.75%時目的蛋白表達效率最高。Western blot分析重組菌誘導培養(yǎng)上清，顯示22kDa的蛋白條帶，證實重組乳酸桿菌確實可分泌hCGβ蛋白抗原。 結(jié)論: hCGβ在Lb. casei CECT5276中得到了穩(wěn)定、分泌性表達。 關鍵詞：hCGβ，乳酸桿菌，分泌，表達 第二部分 表達hCGβ的乳酸桿菌對小鼠陰道免疫及其免疫效果 目的：用穩(wěn)定、分泌性表達hCGβ的乳酸桿菌菌株經(jīng)陰道免疫小鼠，檢測重組菌在小鼠陰道局部的抗原分泌水平及陰道局部特異性IgA抗體水平，并分析抗體產(chǎn)生機制，以探討乳酸桿菌表達外源蛋白抗原經(jīng)粘膜免疫應用于免疫避孕的可行性。 方法：將pCMV4-hCGβ質(zhì)粒磷酸鈣共沉淀法轉(zhuǎn)染COS-7細胞，Western blotting鑒定COS-7細胞所表達的hCGβ蛋白。大量制備pCMV4-hCGβ質(zhì)粒，脛前肌注射免疫8周齡BALB/c雌性小鼠，4周后加強免疫一次。免疫后2周取血清檢測抗hCGβIgG抗體水平。為了解重組乳酸桿菌是否可在小鼠陰道局部定居并分泌表達hCGβ抗原，將109穩(wěn)定、分泌性表達hCGβ的乳酸桿菌Lb caseihCGβ 接種于8周齡BALB/c雌性小鼠陰道，分別于第3、7、14天獲取陰道洗液，放免法檢測hCGβ，以確定重組菌是否可在陰道粘膜局部分泌表達hCGβ。然后，分別將107、108、109Lb caseihCGβ重組菌經(jīng)陰道粘膜免疫8周齡BALB/c雌性小鼠，3周后加強免疫一次。于加強免疫后2周取陰道洗液， ELISA法檢測抗hCGβIgA抗體水平，3H-TdR摻入法檢測hCGβ特異性脾淋巴細胞增殖反應，ELISA檢測經(jīng)抗原刺激后脾細胞分泌Th1型細胞因子IFN-γ和Th2型細胞因子Il-4的水平。為了比較DNA免疫與粘膜免疫的效果，將108Lb caseihCGβ重組菌經(jīng)陰道粘膜免疫 WP=6 BALB/c小鼠，9pmol pCMV4-hCGβ質(zhì)粒肌肉注射免疫另一組BALB/c小鼠，3周后分別取血清和陰道洗液，ELISA檢測血清和陰道局部產(chǎn)生的抗hCGβIgA抗體水平。 結(jié)果：（1）Western blotting顯示COS-7細胞分泌至培養(yǎng)基中的蛋白分子量約為22KDa，與目的蛋白一致。經(jīng)pCMV4-hCGβ肌肉免疫后，小鼠血清中可檢測到抗hCGβIgG抗體。（2）Lb caseihCGβ菌接種于小鼠陰道后第3、7天，2/2只小鼠陰道洗液中可檢測到hCGβ，第14天的陰道洗液中，1/2只可檢測到hCGβ，而用未整合hCGβ的乳酸桿菌經(jīng)陰道粘膜免疫的陰性對照小鼠陰道洗液中未檢出hCGβ，說明該重組菌可在陰道粘膜定居，并分泌hCGβ蛋白。（3）用107、108、109重組菌經(jīng)陰道粘膜免疫小鼠，加強免疫后2周，陰道洗液中檢測到了抗hCGβIgA抗體，hCGβ特異性脾細胞增殖試驗證實脾細胞中含有已被致敏的淋巴細胞；hCGβ刺激后脾細胞分泌的Th1型細胞因子IFN-γ和Th2型細胞因子Il-4均顯著增加，說明乳酸桿菌表達的hCGβ確實能夠通過共同粘膜免疫機制在生殖道局部刺激產(chǎn)生特異性的IgA抗體。（4）將108Lb caseihCGβ重組菌經(jīng)陰道粘膜免疫8周齡BALB/c小鼠，9pmol pCMV4-hCGβ質(zhì)粒肌肉注射免疫8周齡BALB/c小鼠，兩種免疫方式在陰道局部產(chǎn)生的抗hCGβIgA抗體水平無顯著性差異，而兩組血清中均未檢測到抗hCGβIgA抗體。 結(jié)論:　表達hCGβ的乳酸桿菌可在陰道粘膜局部定居；并能通過粘
【學位單位】：復旦大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2003
【中圖分類】：R392
【部分圖文】：

小乳酸桿菌基因組中擴增得到 670bp 的 S-層蛋白表達子+S-層蛋白啟動子+S-層蛋白信號肽序列)(如箭頭所示6 7 為所得片段 泳道 4 為 Marker(DL2000,Takara3.5kb2.0 kb0.9 kb0.5 kb1 2 3

況誘導2124小時的目的蛋白濃度最高其液后目的蛋白濃度又重新上升

Lb.caseihCG菌經(jīng)陰道免疫在小鼠陰道局部誘生抗hCGIgA抗體注第123組分別接種107108109Lb.caseihCGa菌第4組接種109Lb.caseipIlac菌*與第123組比較P<0.01

【引證文獻】

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1 夏春麗;馬廣鵬;陳忠廣;秦玉敏;徐義剛;喬薪瑗;姜雪;李一經(jīng);;乳酸桿菌pPG質(zhì)粒表達系統(tǒng)理想表達條件的探索[J];中國乳品工業(yè);2007年05期

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1 葛俊偉;豬流行性腹瀉病毒主要結(jié)構(gòu)蛋白不同抗原片段在重組干酪乳桿菌中的表達及其免疫學評價[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2008年

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1 夏春麗;乳酸桿菌pPG質(zhì)粒表達系統(tǒng)理想表達條件的探索[D];東北農(nóng)業(yè)大學;2007年

本文編號：2823484