闡明精子功能調(diào)控機(jī)制是診斷和治療男性不育、研發(fā)新型男性避孕藥的前提。離子通道是調(diào)控精子功能的關(guān)鍵因子。精子特異性SL03通道是生理?xiàng)l件下調(diào)控精子功能的主要K＋通道。離體實(shí)驗(yàn)表明,睪丸特異性表達(dá)的LRRC52(Leucine-Rich-Repeat-Containing protein52)具有調(diào)節(jié)SL03通道的功能。然而,LRRC52是否為SL03的在體調(diào)節(jié)亞基尚不清楚。本研究設(shè)計、制備抗LRRC52胞外段的多克隆抗體,對小鼠和正常人精子LRRC52生理功能及其機(jī)制進(jìn)行研究。應(yīng)用分子生物學(xué)、免疫熒光、電生理及精子功能分析等手段,我們發(fā)現(xiàn)LRRC52是SL03通道的在體調(diào)節(jié)亞基,是介導(dǎo)精子鉀電流(IKSper)的關(guān)鍵組分。此外,我們的結(jié)果還提示,LRRC52可作為設(shè)計精子功能調(diào)控化合物的分子靶點(diǎn)。 第一部分LRRC52在小鼠成熟精子的表達(dá)、定位及與SLO3的關(guān)系 為獲得能從細(xì)胞外特異性作用于LRRC52的化合物,我們設(shè)計制備了抗LRRC52胞外段的多克隆抗體(LID1)。通過Western blot、精子凝集實(shí)驗(yàn)、免疫熒光和免疫共沉淀等技術(shù),我們驗(yàn)證了所獲抗體的特異性,研究了在體條件下LRRC52與SLO3的相關(guān)性。結(jié)果表明：1)小鼠精子蛋白中可檢測到LRRC52, LID1孵育的精子發(fā)生明顯的凝集反應(yīng)；2) LRRC52分布于小鼠精子尾部,尤以中段明顯,并與SLO3存在明顯的共定位；3)小鼠精子LRRC52與SLO3構(gòu)成蛋白復(fù)合體。這些結(jié)果提示,LRRC52是SLO3的潛在調(diào)節(jié)亞基。 第二部分LRRC52對小鼠成熟精子膜電流的影響 為闡明LRRC52的生理功能,我們應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)研究了LID1對精子膜電流的影響。結(jié)果表明：1)LID1顯著抑制小鼠IKSper但不影響精子鈣電流(ICatSper);2) LID1對IKSper電導(dǎo).電壓曲線(G-V曲線)的影響與異體表達(dá)系統(tǒng)中LRRC52亞基對SL03的作用相符。這些結(jié)果提示LRRC52是構(gòu)成精子鉀通道、介導(dǎo)精子鉀電流的重要組分。 第三部分LRRC52對小鼠成熟精子生理功能的影響 應(yīng)用計算機(jī)輔助精子分析(CASA)、金霉素(CTC)染色、體外受精(IVF)、調(diào)節(jié)性體積下降(RVD)檢測等實(shí)驗(yàn)手段,我們觀察了LID1對精子活力、頂體反應(yīng)(AR)、體外受精能力及RVD等相關(guān)生理功能指標(biāo)的影響。結(jié)果表明：1)LID1顯著抑制小鼠精子總運(yùn)動力、直線速度(VSL)、曲線速度(VCL)和平均路徑速度(VAP)；2)LID1不影響自發(fā)性AR的發(fā)生率,但顯著抑制A23187誘發(fā)的AR發(fā)生率；3)LID1孵育對精子RVD能力的影響不顯著；4)LID1顯著抑制小鼠精子的體外受精率。這些結(jié)果提示,LRRC52在精子生理功能中扮演重要角色,是開發(fā)調(diào)控精子功能化合物的潛在分子靶點(diǎn)。 第四部分LRRC52在人成熟精子的表達(dá)及其生理功能 介導(dǎo)人精子IKSper的離子通道分子組成尚不清楚。由于用于制備LID1的LRRC52抗原片段在小鼠與人完全相同,我們用LID1初步觀察LRRC52在人精子的表達(dá)及其可能的生理功能。結(jié)果表明：1) LRRC52和SLO3均在人精子蛋白中有表達(dá),二者主要分布于精子尾部中段；2)LID1降低人精子頂體反應(yīng)的發(fā)生率；3)LD1抑制人精子總運(yùn)動力和曲線速度(VCL)。這些結(jié)果提示,LRRC52可能扮演與其在小鼠精子上類似的功能角色。
【學(xué)位單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2013
【中圖分類】：R321.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2823166